杨鸿林，蒋廷旺，龚燕萍，沈昊，钱靖，钮丽萍，朱安渡，钱雄杰

(1. 苏州市第九人民医院检验科，江苏苏州 215200；2. 常熟市第二人民医院科技处，江苏常熟 215500；3. 常熟市医学检验所，江苏常熟 215500)

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一种好发于女性，以肝内小胆管炎性损伤为早期病理改变的自身免疫性肝病。尽管研究发现T细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)在PBC炎性损伤过程中发挥重要作用，但是其确切的发病机制仍不明确。B细胞在产生自身抗体、调节炎性介质释放及维持机体对自身抗原免疫耐受平衡方面发挥重要的调节作用。通常情况下，B细胞辅助T细胞的活化和增殖，但是近年来研究发现B细胞通过产生IL-10、TGF-β或细胞间直接相互作用发挥负向免疫调控作用，称之为调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)[1]。我们前期研究发现Breg通过产生IL-10在慢性乙型肝炎中发挥重要的免疫调节作用，导致了机体抗病毒能力下降[2]。此外，有研究发现，腺苷代谢通路相关分子CD39和CD73在B细胞表面的表达情况与免疫抑制作用存在紧密相关性[3]。但是PBC患者中B细胞表面CD39和CD73分子的表达情况如何，其变化对PBC有着怎样的意义目前尚无相关研究，本研究就此作初步探讨。

1 材料和方法

1.1研究对象 连续、随机选择2017年1月至2018年12月期间苏州市第九人民医院和常熟市第二人民医院初次就诊的PBC患者60例，男16例，女44例，年龄[中位数(四分位数)]为58.5(52.3, 70.8)岁；体检健康者(health controls, HCs)40例，男11例，女29例，年龄56.0(50.0, 69.0)岁。符合以下3个条件中的任意2个诊断为PBC[4]：血清抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody, AMA)滴度≥40；不明原因的血清碱性磷酸酶(ALP)超过正常水平1.5倍，且持续24周以上；肝内汇管区小胆管损伤。所有病例排除肝癌、病毒性肝炎及其他自身免疫病。

1.2主要试剂和仪器 anti-CD39-PE(555464)、anti-CD73-PerCP-cy5.5(561260)、anti-CD19-FITC(555412)(美国BD公司)，Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液(美国GE公司)，多重微珠流式荧光抗核抗体谱检测试剂盒(美国宙斯公司)，免疫印迹自身抗体试剂盒(德国欧蒙公司)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)试剂盒及复合校准品(日本世诺公司)，ALP试剂盒(中国九强公司)，总胆红素(T-Bil)及复合校准品(中国伊谱诺康公司)；荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)，全自动生化免疫分析仪(德国西门子公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3标本采集和流式细胞术 采集患者清晨空腹血分别于肝素锂抗凝管和无抗凝剂促凝管，抗凝血用于流式细胞术分析，促凝血3 000 r/min离心10 min后进行肝功能相关指标分析。分离抗凝血外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，然后将分离的细胞重悬于RPMI 1640完全培养基中(10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，调整细胞浓度至1×106/mL。在每个流式上样管中加入100 μL 全血样本，加入anti-CD19-FITC、anti-CD73-PerCP-cy5.5和anti-CD39-PE抗体各10 μL，混匀，室温避光反应15 min；加入2 mL溶血素，混匀，室温避光反应15 min；加入2 mL(pH7.2)PBS，混匀，1 500 r/min 5 min弃上清液；加入约500 μL PBS，混匀，待测。流式细胞仪检测后以FlowJo软件进行数据分析。

1.4自身抗体检测 用多重微珠流式荧光法定量分析抗线粒体抗体M2(anti-mitochondrial antibody M2, ANA-M2)IgG抗体，按试剂盒说明书进行。取出试剂盒平衡至室温并将微珠和配套试剂混匀；阴性对照、阳性对照和患者标本按照1∶21稀释；每孔加入50 μL复合微珠悬浮液后加入10 μL稀释后的样本和对照品；室温放置30 min后，用真空抽滤泵移除孔内溶液后洗涤3次；轻轻吸干过滤板底部并在空气中晾干3～5 min；每孔中加入150 μL结合剂，室温再次放置30 min后，读取和分析数据，结果判读标准：<120为阴性；≥120为阳性。用免疫印迹法检测抗糖蛋白210抗体(anti-GP210)、抗核蛋白体100抗体(anti-SP100)，参考试剂盒说明书进行。

1.5统计学分析 以SPSS 19.0软件进行。定量数据以中位数(四分位数)表示，组间差异以Mann-WhitneyU秩和检验进行统计分析；定性数据以率表示，用卡方检验进行统计分析；以Spearman相关分析指标间相关性。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1患者基本资料 PBC患者及对照组年龄、性别差异无统计学意义；PBC组肝功能相关指标ALT、AST、ALP、GGT和T-Bil较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05);PBC组AMA-M2均为阳性，anti-GP210阳性14例(23.3%)，anti-SP100阳性12例(20.0%)。见表1。

表1 PBC患者和健康人对照者实验室检查结果

2.2CD39+CD73+B细胞在PBC患者中的变化情况 PBC组CD39+CD73+B细胞在B细胞中所占比例为55.6%(44.9%，60.5%)，健康人对照组为73.0%(69.8%，74.9%)，PBC组较对照组显著降低，差异有统计学意义(Z=7.691,P<0.001)。见图1。

注：A、B为PBC患者，C、D为健康人对照者。

2.3PBC组CD39+CD73+B细胞与自身抗体的关系 将PBC组CD39+CD73+B细胞和AMA-M2定量检测结果进行相关性分析，结果发现两者呈明显的负相关关系，差异有统计学意义(r=-0.349，P=0.027)，见图2；anti-GP210阳性组CD39+CD73+B细胞比例为44.6%(38.2%，49.9%)，明显低于anti-GP210阴性患者58.7%(49.8%，63.8%)，差异有统计学意义(Z=4.099，P<0.001)；anti-SP100阳性组为58.6%(47.9%，62.7%)，阴性组为51.6%(44.7%，60.4%)，差异无统计学意义(Z=1.054，P=0.292)。

图2PBC组CD39+CD73+B细胞与AMA-M2定量结果之间相关性分析

3 讨论

近年来B细胞在肿瘤、自身免疫病中的作用再次成为研究热点，研究发现其在肿瘤增殖、自身免疫炎性反应免疫调控中的作用明显被低估[5]。在一些自身免疫病(如类风湿关节炎、多发性硬化、SLE等)中B细胞的调节机制尚不明确，研究发现Breg可以通过产生IL-10、TGF-β、IL-35、IgM和IgG4等多种免疫分子参与免疫应答的调控[6]。既往研究认为Breg主要通过IL-10发挥免疫调节作用，但是能够产生IL-10的B细胞无论在活化或是非活化状态下均较少，即使通过IL-4和CD40L进行体外活化仍然处于较低水平[7]。近期的研究发现CD39和CD73在B细胞表面呈现高表达，且腺苷代谢通路在肿瘤和自身免疫病中均有重要的免疫调节作用，因此也有学者将CD19+CD39+CD73+B细胞定义为调节性B细胞，并发现通过抗肿瘤治疗后产生腺苷(adenosine，ADO)的B细胞显著降低，且CD39表达水平与ADO表达水平呈显著相关，证明了Breg通过产生ADO抑制CD4+T细胞的活化增强了抗炎效果[8]。本研究首次对PBC患者外周血同时表达CD39和CD73的B细胞进行分析，结果发现与健康人对照比较，其CD39+CD73+B细胞比例显著降低。我们之前的研究发现PBC患者调节性T细胞(Treg)表面CD39分子表达显著降低，而CD73无明显变化[9]，提示腺苷代谢通路紊乱在PBC的发病机制中具有一定作用。ATP具有促进炎症反应的作用，在CD39和CD73的作用下转变为ADO，ADO可以抑制CD4+、CD8+T细胞和NK细胞的活化发挥免疫调控作用，通过降低炎性介质的释放抑制炎症反应。因此，一方面，PBC患者B细胞中CD39和CD73分子的低表达可能会导致ATP在体内积聚，从而导致炎性损伤加剧，促进PBC进展；另一方面，PBC患者B细胞的CD39和CD73低表达有可能直接导致患者肝组织内ADO产生减少，促进了抗原特异性T细胞的活化，进而促进了PBC患者的炎性损伤和病程加剧。之前在Treg的研究中我们通过高效液相色谱串联质谱技术已经发现PBC患者血清ATP水平确实有所增加，这进一步印证了腺苷代谢通路在T、B细胞水平上均出现异常，促进了PBC的发生和发展。

PBC患者血清自身抗体主要包括AMAs和抗核抗体(anti-nuclear antibodies, ANAs)，其中90%以上患者血清AMAs阳性，而ANAs阳性率大约50%。AMAs中与PBC相关的主要是AMA-M2、AMA-M4、AMA-M8、AMA-M9，ANAs的主要特异性靶抗原包括anti-SP100蛋白、核小体主要组成部分和核膜部分。核孔复合体是核膜的组成部分，包括100多种蛋白质，其中最重要的是糖蛋白210(GP210)[10-11]。除AMA-M2之外，anti-GP210和anti-SP100是PBC最重要的特异性自身抗体，本研究中PBC患者两者阳性率分别为23.3%和20.0%。国外有研究报道PBC中anti-GP210 阳性率为25%，与本研究基本一致，但是anti-SP100 为44%，显著高于本研究，有可能与人种人群不同有关[12-13]。anti-GP210阳性患者CD39+CD73+B细胞比例低于阴性患者，而且PBC患者CD39+CD73+B细胞与AMA-M2定量检测结果呈负相关关系，一方面提示该B细胞亚群可能参与调解PBC自身抗体产生过程，另一方面，可能与PBC患者病情严重程度存在相关性。有研究表明，anti-GP210抗体阳性的PBC患者临床预后明显较差。而AMA-M2在病情严重程度方面存在争议[14]。由此可见，CD39+CD73+B细胞比例的降低对于PBC的病情可能存在提示作用，CD39和CD73的低表达可能促进了肝内腺苷代谢通路的紊乱，加剧了炎性损伤。但是PBC患者B细胞对ATP的分解代谢能力及其具体的作用机制需要进一步以体外试验进行研究，本研究只能从理论上对此进行推导。