李换丽，王丹，张树伟，雷佳，吴霞，王新胜，马燕斌

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

大豆（Glycine max L.Merrill）是我国主要的粮油作物，在国民经济中占有重要的地位[1]，同时它也是我国主要的栽培作物[2]。但是由于外界生物胁迫（病虫害）[3]、非生物胁迫（干旱、盐碱、重金属）[4-5]等环境的不利影响，致使自主育种的大豆产量和品质严重下降，不能满足国内消费者的需求[6]。短时间内，我国大豆需求主要还是依靠进口，培育优质大豆品种迫在眉睫[7]。而山西由于独特的地理优势被称为小杂粮之国，大豆作为其中的一种主要作物，其产量低、抗病性差等缺点限制了大豆育种的进程[8]。2019年，国家大力开展大豆振兴计划。然而常规育种方法周期长，且有一定的局限性。通过转基因技术改善大豆品质是目前的有效途径，它具有缩短育种周期、效率高等优点[9-10]。利用大豆遗传高效的转化体系和再生技术进行遗传改良是转基因大豆的主要措施。最早关于大豆遗传转化的外植体是由CHENG等[11]研究报道，于1980年通过子叶节再生体系成功获得再生植株。此后，如下胚轴、胚尖、未成熟的种子等不定芽器官发生系统被相继报道[12-13]。其中，子叶节和胚尖再生体系是目前在大豆遗传转化试验中应用最多的外植体，但是由于受体遗传背景的限制，转化效率和再生率差别很大，能够进行遗传转化的材料非常少，造成大豆在遗传转化中依然存在许多困难[14]，因此，选择再生能力强的基因型是大豆遗传转化的首选条件。

近年来研究发现，不同大豆由于遗传背景的差异使不定芽器官诱导结果不同。首先，表现为不同品种大豆在同种再生体系中的再生率不同[15-17]。其次，相同大豆在不同的再生体系中再生率存在很大差异。研究发现，合丰46号在胚尖再生体系中的再生率明显优于子叶节体系[18]，黑农51号在子叶节再生体系中的各个指标均高于胚尖体系[19]，黑农37号在胚尖再生体系中的不定芽诱导率、伸长率及个数均明显高于子叶节再生体系[18，20]。而对于山西省的主栽品种再生能力未见报道。

本试验选取10个大豆品种进行再生体系的研究，通过比较不同大豆在子叶节和胚尖再生体系中不定芽诱导率、伸长率、生根率及再生苗成活率等参数的差异，以期选择再生能力强的品种及适合的外植体，为后期山西的大豆遗传转化试验提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所采用的大豆分别是晋豆25号、晋遗30号、晋遗31号、晋科4号、晋科2号、邯豆5号、中黄13号、晋豆19号、晋豆36号和晋豆37号，总共10个品种。其中，中黄13号为对照。试验材料均由山西省农业科学院小麦研究所、经济作物研究所和农作物品种资源研究所提供。

试验利用子叶节培养基（表1）和胚尖培养基（表2）2种途径进行再生株诱导。其中，所用的基础培养基需经过121℃高压灭菌20 min，冷凝后备用。然后将激素加入（激素需通过过滤器除菌后），混匀，备用。

表1 子叶节再生体系的培养基

表2 胚尖再生体系的培养基

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒采用过氧化氢消毒法。选取表面干净、大小一致的大豆种子于通风处，用无菌水洗净后浸泡3 min，再用75%酒精浸泡5 min，最后用15%过氧化氢消毒90 min，期间在摇床进行，获得无菌种子。

1.2.2 外植体的获得子叶节获取参考MA等[21]的方法，并稍做改动。将获得的无菌种子在无菌水中浸泡16～18 h，然后去除种皮，接种在发芽培养基上1～7 d，获得无菌苗，期间培养温度24℃。去掉大豆无菌苗的顶芽和腋芽并切掉下胚轴，留有3 mm左右的下胚轴与子叶相连的部位即可，沿子叶节纵向切开备用，同时在子叶节部位纵向划3～5刀，切去1/3子叶，获得子叶节外植体。其中，试验分别选取萌发1、3、5、7 d的外植体进行研究。每个外植体100粒，5次重复。

胚尖获取参考LIU等[13]的方法。将获得的无菌种子在无菌水中浸泡16～18 h，去除种皮，去掉子叶和原叶，分离得到胚尖外植体。

1.2.3 不定芽诱导及伸长子叶节诱导时将外植体斜插45°接种在芽诱导培养基上，待子叶节部位长出不定芽，统计芽诱导数及诱导率；然后将其接种在子叶节再生体系的芽伸长培养基上，当芽长2～3 cm时，统计芽伸长率。胚尖诱导时将胚尖朝上，接种在芽诱导培养基上，统计芽诱导数及诱导率；然后切去胚尖的褐色基部，继续接种在胚尖再生体系的芽伸长培养基上，当芽长2～3 cm时，统计芽伸长率。

试验过程中将子叶节和胚尖芽诱导培养基置于光照16 h，黑暗8 h，白天温度25℃左右，夜晚22℃的培养间培养。

1.2.4 不定根的诱导及再生植株形成待芽长出2～3 cm时，将其接种在生根培养基上15 d，待其长出主根，进而获得子叶节再生苗，统计生根率。获得再生苗后，打开组培瓶盖炼苗3 d，然后移入灭菌的蛭石土花盆中，用薄的塑料膜密封保湿，成活后收种子，统计再生苗的成活率。

1.3 数据分析

利用SPSS 19.0软件进行相关数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同萌发时间对大豆子叶节再生体系中不定芽诱导数的分析

通过对10个不同大豆品种不同萌发时间的外植体进行子叶节再生体系的研究，结果表明，大豆的萌发状态影响后期再生体系的不定芽诱导数。由图1可知，除中黄13号外，其他大豆品种都是随萌发时间延长，子叶节再生体系的不定芽诱导数增多，在萌发5 d时达到最高峰，而后随萌发时间延长，不定芽诱导数下降。而中黄13号在萌发第5天未达到最大值。通过比较不同大豆品种在不同萌发时间的外植体的不定芽数发现，中黄13号在萌发第7天不定芽诱导数较其他萌发时间多，为74个。其他品种都是在萌发第5天达到最多。不定芽诱导数在一定程度上反映了此大豆品种的再生能力。因此，后期需要以萌发第7天的中黄13号外植体萌发状态和萌发第5天的其他品种大豆外植体状态进行研究。

2.2 不同大豆品种在不同再生体系中不定芽诱导数的比较分析

表3 不同大豆品种在不同再生体系中芽诱导数的比较

通过不同大豆品种在不同再生体系中不定芽诱导数的比较发现，品种和再生体系都能够影响大豆的再生能力和不定芽诱导数。由表3可知，在子叶节再生体系中的不同品种大豆的不定芽诱导数不同，且差异达到显著水平。其中，晋豆25号不定芽诱导数最少，为22.6个；晋豆37号不定芽诱导数最多，为183.0个。介于中间的不定芽诱导数由少到多依次为：晋遗30号、晋遗31号、晋科4号、晋科2号、邯豆5号、晋豆19号、晋豆36号、中黄13号。通过不同大豆品种在胚尖再生体系中比较分析发现，不定芽诱导数不同且差异显著。其中，晋遗31号不定芽诱导数最少，为35.4个；晋豆36号不定芽诱导数最多，为184.2个。中间不定芽诱导数由少到多依次为：晋豆25号、晋遗30号、晋科4号、晋科2号、晋豆19号、邯豆5号、晋豆37号、中黄13号。

从表3还可以看出，晋豆25号、晋遗30号、晋遗31号、晋科4号和晋科2号不定芽诱导数在2种再生体系中均未达到1/2，其再生能力较差。而晋豆19号、晋豆36号、中黄13号和晋豆37号在2种再生体系中的不定芽诱导数超过半数，芽诱导能力较好。此外，邯豆5号在胚尖再生体系中的不定芽诱导数为132个，但在子叶节再生体系中为82.4个，可能较适合在胚尖再生体系中进行研究。

因此，最终选择芽诱导能力较好的5个大豆品种：晋豆19号、晋豆36号、晋豆37号、中黄13号和邯豆5号进行后期不同参数的比较，以便为下一步大豆遗传转化受体提供参考。

2.3 不同大豆品种在不同再生体系中的参数研究

从图2可以看出，不同大豆品种对子叶节再生体系和胚尖再生体系中不定芽诱导率、不定芽伸长率、生根率及再生苗成活率的影响存在差异。

通过子叶节再生体系不同大豆品种试验，结果表明，晋豆37号芽再生率最高，为91.5%，中黄13号虽然不定芽诱导率（90.6%）小于晋豆37号，但二者没有明显差异。晋豆36号诱导率比中黄13号小且差异显著。邯豆5号诱导率最低。而伸长率最多的同样是晋豆37号，其次是中黄13号，最低的为邯豆5号。生根率由大到小依次是：晋豆37号、中黄13号、晋豆36号、晋豆19号和邯豆5号。再生苗成活率的变化趋势和伸长率一致。芽诱导率高的受体材料其伸长率、生根率及后期再生苗成活率也相对较高。

胚尖再生体系各个大豆品种试验结果表明，晋豆36号不定芽诱导率最高，为92.1%，其次为中黄13号，芽诱导率最少的是晋豆19号。不定芽伸长率的变化趋势和诱导率一致。再生苗生根率最高的为晋豆36号，而晋豆37号最少。再生苗成活率由大到小依次为：晋豆36号、中黄13号、邯豆5号、晋豆19号、晋豆37号。由4个统计指标可知，晋豆36号的不定芽诱导率、不定芽伸长率、生根率及再生苗成活率均高于其他大豆品种，且差异显著，而中黄13号次之。晋豆37号的不定芽诱导率、不定芽伸长率虽比邯豆5号的高，但生根率和再生苗成活率却明显低于邯豆5号。

相同大豆品种在2种再生体系中不定芽诱导率、不定芽伸长率、生根率及再生苗成活率不同。其中，邯豆5号、晋豆19号、晋豆36号在子叶节再生体系中的4个统计指标值均明显低于胚尖体系，因此，较适合用于胚尖再生体系的研究。中黄13号与晋豆37号在子叶节再生体系中的各项数值均比在胚尖体系中的高，其较适合用于子叶节再生体系的研究。

3 结论与讨论

高效的再生转化体系平台是大豆遗传转化所必须的。目前在大豆转化方面仍然存在芽诱导率低、再生率差、重复率少等缺点。虽然已经通过多个大豆材料进行试验研究，但是用于高效遗传转化的受体材料仍需要进一步挖掘，其稳定性仍有待提高。

前期研究发现，适合子叶节再生体系且用于再生体系研究的大豆品种主要有：黑农51号、合丰25号、合丰35号、黑农40、中黄13号等[19，22-23]，适合胚尖再生体系的品种有：黑农37号、北京小粒豆等[17]。但是关于其他品种研究甚少。对于山西境内栽培的品种更是未见报道。除中黄13号外，试验选取的其他9个大豆品种都适宜在山西境内种植，中黄13号适合在北京种植。其中试验选取的中黄13号和王卢平等[23]的外植体状态不同，分别是成熟种子和未成熟种子，但都是在子叶节再生体系中再生率高。

研究发现，在大豆子叶节再生体系的遗传转化中，外植体的萌发状态能够影响后期遗传转化效率。王爽等[9]通过对萌发1～5 d的大豆外植体研究发现，可根据萌发状态的真叶长度、下胚轴长度等指标作为标准，用于指导后期大豆遗传转化的试验研究。YANG等[24]研究发现，萌发1 d的子叶节外植体其遗传转化效率可提高14.71%。但是由于品种不同，种子活力不同等原因，大豆的萌发状态很难用单一的指标进行说明，也可通过不同萌发时间点的外植体再生体系参数进行补充说明。本试验通过对10个大豆品种不同萌发状态的外植体进行后期芽诱导数的研究发现，同一萌发时间的不同品种大豆的子叶节再生体系中芽诱导数不同，相同大豆品种的外植体在不同的萌发状态其芽诱导数也不同。除中黄13号是在萌发第7天的外植体再生能力较强外，其他品种都是萌发第5天的较强于其他时间点。

本试验发现，不同大豆品种在相同再生体系中再生率不同。其中，晋豆37号与中黄13号在子叶节再生体系中不定芽诱导率、伸长率、生根率及再生苗成活率等参数明显高于其他品种，具有较高效的再生率及成活率。而在胚尖再生体系中，晋豆36号的各项指标值均高于其他品种，适合用于后续试验研究。同一大豆品种在不同的再生体系中表现也不同。邯豆5号、晋豆19号、晋豆36号在子叶节再生体系中的4个指标数值均明显低于在胚尖体系，比较适合胚尖再生体系。中黄13号和晋豆37号在子叶节再生体系中的各项数值均比在胚尖体系中的高，较适合子叶节再生体系。针对出现这样的差异，可能与选取的外植体不同有关，子叶节一般是无菌苗生长1～7 d后获取，而胚尖是通过种子灭菌后再浸泡过夜后获取，其外植体获取时间不一致，导致大豆生理活性不同，进而影响后期芽诱导的能力不同，且外植体再生能力也可能和不同激素的组合、组培温度、光照等有关[25-27]。这些试验结果可为后期加快山西省大豆遗传转化提供一定的参考。