王 梅， 杨兴林， 张 流， 王 军， 王 艺

贵阳市公共卫生救治中心 a.肝病科； b.检验科，贵阳 550004

HCV为黄病毒科肝炎病毒属，其基因组为单股正链RNA，全基因组约9.6 kb。根据全基因组核苷酸序列的差异性及Simmonds分型系统，可将HCV分为6种基因型和80多种不同亚型[1-2]。随着核苷酸测序技术的进步，HCV序列数据进一步扩大，使用共识标准可将HCV分为7个确认基因型和67个亚型以及21个待定的基因亚型[3]。由于HCV基因型与肝病进展及干扰素或直接抗病毒药物(DAA)抗病毒疗效的关系密切，因此HCV基因分型对丙型肝炎的防控具有重要意义。但随着主要传播途径的改变及各地人员流动性的增加，近年来全国多数地区对HCV感染者流行病学调查表明HCV基因型分布已发生改变。本研究采用RT-PCR产物直接测序法，对贵州地区HCV感染者进行基因分型，旨在分析该地区HCV流行株的基因型，及不同基因型在传播途径、性别、年龄、民族中分布的差异性，为HCV感染的防控和临床个体化治疗提供重要依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2011年9月-2018年10月本救治中心门诊及住院的HCV RNA>500 IU/ml患者，根据《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]中的诊断标准进行诊断。本研究经贵阳市公共卫生救治中心伦理委员会审批通过。

1.2 血清标本收集 抽静脉血3 ml，离心后取血清1.0 ml用eppendor离心管分装，-80 ℃保存标本，采样同时收集患者临床资料。

1.3 HCV基因型检测

将已确定HCV RNA>500 IU/ml的标本通过逆转录巢式PCR扩增C基因羧基端至E1基因氨基端长度为474 bp的片段，测定其核苷酸序列，与GenBank中已知的HCV序列进行系谱分析，确定HCV基因型及亚型。

1.3.1 引物合成 根据已公布的序列，于HCV Core-E1区核苷酸序列合成2对引物(由上海生工公司合成)，引物序列：CEI-ESP(正向) 5′-GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC-3′(834-859位核苷酸)；CEI-EAP(反向) 5′-CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT-3′(1328-1305位核苷酸)；CEI-ISP(正向) 5′-AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT-3′(502-527位核苷酸)；CEI-IAP(反向) 5′-GTTCATCATCATATCCCATGCCAT-3′。

1.3.2 HCV RNA提取 采用Qiagen公司QIAamp viral RAN mini kit提取RNA：用异硫氰酸胍Trizol-氯仿-异丙醇提取血清中的HCV RNA，75%的乙醇洗涤RNA沉淀，15 μl DEPC水溶解核酸后于-70 ℃保存或水浴备用。

1.3.3 逆转录巢式PCR 逆转录及首轮PCR同时进行，反应体系50 μl。反应条件：42 ℃ 50 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min，得到外扩增PCR产物。取2 μl扩增产物为模板进行第2轮PCR，循环参数与第1轮PCR相同，最终得到内扩增PCR产物，片段474 bp。产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳30 min，通过凝胶成像分析仪观察结果。每次实验均设置阳性、阴性对照及空白对照。将阳性PCR产物用Promega的PCR DNA纯化体系进行纯化后，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，CE1-ISP为测序引物。所得序列用DNALASER 7.1.0进行HCV亚型鉴别。

参考序列取自美国国立生物技术信息中心：1a AF271632、1b D90208、2a D00944、2b D10988、3a D17763、3b D49374、4a Y11604、5a Y13184、6a Y12083、6b D84262、6d D84236、6e EU246931、6k D84264、6n DQ278894、6v EU798761。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入HCV RNA>500 IU/ml患者1211例，其中男767例，女444例，年龄6～84岁，平均(40.54±9.95)岁。1211例患者中汉族946例，苗族80例，土家族57例，布依族56例，侗族30例，蒙古族2例，彝族13例，水族9例，穿青族7例，仡佬族5例，回族4例，黎族1例，白族1例；贵阳市647例，遵义市27例，铜仁市108例，黔西南39例，黔南106例，黔东南46例，六盘水市32例，毕节市152例，安顺市54例。

2.2 HCV基因型和基因亚型 1211例样本共检出4种基因型、11种基因亚型，贵州地区HCV感染者基因流行株以1b、3b、6a型为主，同时检测出 HCV 6型中的多种少见亚型。非1型占比明显高于1型(70.85% vs 29.15%，χ2=210.59，P<0.001)(表1)。

2.3 比较不同性别、年龄、地区、传播途径中HCV基因型分布的差异

2.3.1 不同性别中HCV基因型分布特点 1211例患者中男性占63.33%(767/1211)，女性占36.67%(444/1211)。因6d、6k、6e、6n、6v型样本例数过少，故与6a型合并，按6型分析。结果显示，1a、1b、2a、3a、3b、6型这6种基因型在男女患者中分布差异有统计学意义(χ2=15.428，P=0.009)；男性感染者中3b型所占比例最高，而女性中1b型所占比例最高(表2)。

表1 HCV基因型和基因亚型构成比

2.3.2 不同年龄组中HCV基因型分布特点 按年龄进行分组，分析不同年龄组感染者的基因型分布。结果显示，不同年龄组中各种HCV基因型分布差异有统计学意义(χ2=67.439，P<0.001)。其中低年龄组(≤18岁)和高年龄组(≥60岁)以1b型为主，分别为66.67%(4/6)和58.93%(33/56)；19～39岁组以3b、6型为主；40～59岁组以1b、3b及6型为主(表3)。

2.3.3 不同民族中HCV基因型分布特点 分析结果显示，不同HCV基因型在民族间分布差异无统计学意义(χ2=20.776，P=0.316)(表4)。

2.3.4 不同地区中HCV基因型分布特点 贵阳地区以1b、3b和6型为主，3a型次之；遵义、黔西南、黔东南、毕节、黔南地区以1b型为主，6型次之；六盘水地区以1b型为主，3b型次之；铜仁地区以3b型为主，6型次之；安顺地区以3b型为主，1b、3a型分布比例相同。各地区HCV基因型分布差异无统计学意义(χ2=39.279，P=0.349)(表5)。

2.3.5 不同感染途径中HCV基因型分布特点 1211例患者中静脉药瘾(吸毒)702例， 手术外伤史(包括牙科治疗)75例，有创美容史102例，输血或血液透析史90例，与HCV患者性接触史102例，母婴传播6例，不明原因感染者129例，此外有5例职业暴露者。各种感染途径的HCV基因型分布差异有统计学意义(χ2=153.916，P<0.001)；1b型主要见于经输血途径感染，经静脉药瘾和有创美容感染HCV者以3b型为主，性接触HCV感染者以6型为主(表6)。

3 讨论

HCV感染是世界范围内慢性肝病的主要原因之一[5]，感染后起病隐匿，慢性化程度高，是导致肝硬化、肝细胞癌的主要病因之一。据世界卫生组织数据统计，目前全球约有1亿8000万人感染HCV，其中7100万慢性感染者[5]。HCV在世界不同地区的分布有很大差异，由于病毒的高度异质性，其基因型分布也具有明显的地域差异。一项分析包括1217项HCV基因型研究[6]数据表明：HCV基因1型仍是主要流行的基因型，约8340万例(占HCV感染者的46.2%)，在东亚地区，基因1型约占所有基因型的1/3；其次为基因3型，约5430万例，占30.1%；基因2、4和6型共为22.8%；基因5型小于1%；85个国家基因1型最常见，主要是南美洲及北美洲国家，美国、墨西哥以1a型为主，其次是1b型；基因2型在非洲西部最常见；基因3型在南亚和斯堪的纳维亚半岛部分地区较常见；基因4型在非洲中部、北部常见；基因5型在南非最常见。近期有学者[7]于印度发现基因8型的存在，在中非分离出基因7型[8]。同时分析[6]提示，中国和许多东南亚国家以及西欧和澳大利亚的基因型分布多样性较高。我国主要流行的HCV基因型为1、2、3和6型，其中以1b型为主(56.8%)，其次为2型(24.1%)和3型(9.1%)，6型相对较少(6.3%)[4]。此外，南北分布存在一定的差异性，北方地区以1b、2a为主，而南方地区基因型种类较多，分布呈多样性，以1b型为主，2a、3a、3b及6a各占较大比例[9]。贵州地区HCV基因型分布亦体现了这一特点。本研究发现HCV基因型有：1a、1b型，2a型，3a 、3b型，6a、6d、6e、6k、6n、6v型。其中主要流行株为3b、1b、6a型，其次为3a型；非1型占70.85%，明显高于1型(29.15%)，这与国内报道的总体流行趋势不同[4]，与哈尔滨等北方地区报道的流行情况[10]差异较大，但与近几年西南地区流行株主要为1b和3b的报道[11-12]相近。然而本研究与贵州地区以往流行病学调查结果[13-14]有所不同，3b和6型占比明显增加，可能的原因有：(1)样本量较以往研究多，研究对象不仅仅是单纯的慢性丙型肝炎患者。随着DAA的应用，失代偿期肝硬化、毒瘾未戒断、甲亢等干扰素治疗禁忌的患者就诊率明显增加也是原因之一；(2)更可能的因素是与近几年流动人口增加、生活方式改变导致不同感染途径比例的变化有关。

表2 不同性别HCV基因型分布[例(%)]

表3 不同年龄组HCV基因型分布[例(%)]

表4 不同民族HCV基因型分布[例(%)]

注：其他民族包含侗族、蒙古族、彝族、水族、穿青族、仡佬族、回族、黎族、白族。

表5 不同地区HCV基因型分布[例(%)]

表6 不同感染途径HCV基因型分布[例(%)]

以往报道输血、静脉药瘾者和手术是我国HCV流行的主要危险因素[15]，但近年来，随着国家对采供血机构及血源的严格管控和献血人员的积极筛查，经输血或单采血浆等方式感染HCV的比例明显下降；但随着静脉药瘾者增多、生活方式的改变，因吸毒、性接触、有创美容等方式感染HCV的人数逐渐增加。在本次调查中，因静脉药瘾感染HCV的比例最高(57.97%)，其次为性接触(8.42%)和有创美容(8.42%)。HCV基因型分布格局也随之改变。HCV基因3型和6型主要在静脉药瘾者中流行，在广东及中国香港的静脉药瘾者中HCV基因型以6a型为主[16-17]；而3a和3b亚型是上海浦东吸毒者中HCV感染的主导基因型[18]；广西、云南等地HCV 6a和3a型较多[19]。本研究结果显示HCV基因型分布与感染途径有关，经输血途径、外伤、拔牙等血源途径感染HCV的基因型以1b型为主，3b型多见于静脉药瘾、有创美容者；性接触感染者多分布于6型。另有部分HCV感染者的传播途径不明，其基因型以1b型为主，其次为6型和3b型，该部分患者多有不正规针灸、拔罐、不安全注射史及足浴等行为。由此可见，传播方式多样化发展是导致HCV基因型分布多样性的重要原因之一。同时本次调查中发现有4例静脉药瘾丙型肝炎患者，经规范DAA治疗后再次感染不同基因型HCV。随着DAA的广泛使用，HCV感染治愈不再是难题，这也提示HCV不同基因型反复感染的比例有可能增多，为今后HCV的防控提出了新的挑战。

虽然HCV基因型在全球及全国的地域分布存在差异，但本研究显示贵州省内各地区分布并无统计学差异。从性别、年龄分布来看，国内外报道HCV基因型与性别、年龄的相关性各有不同，对我国西南地区HCV感染者基因型的研究[20]提示HCV基因型分布与性别相关；彭雪彬等[21]报道HCV基因型分布与年龄无相关性，而李威等[22]研究显示我国HCV 6a型丙型肝炎患者较为年轻。本研究结果显示贵州地区不同HCV基因型感染者的性别、年龄分布差异均有统计学意义(P值均<0.05)；男性感染者中3b型所占比例明显高于其他基因型，而女性感染者1b型所占比例最高，这与以往报道[14]不同。可能与男女感染途径不同有关，本研究数据显示女性有创美容和输血感染比例(18.47%、12.16%)高于男性(2.61%、4.69%)，而男性静脉药瘾感染比例高于女性(70.40% vs 36.49%)。提示近年来女性感染HCV的途径更多样。本研究年龄分布显示，低年龄组(≤18岁)和高年龄组(≥60岁)以1b型为主，而19～39岁组以3b、6型为主，40～59岁组1b、3b及6型为主要流行株。年龄分布的差异可能与不同年龄主要的感染方式不同有关，低年龄组患者多为母婴垂直传播，高年龄组的感染方式以输血感染多见；而中间的两组年龄段因感染方式多样，基因型分布呈多样性。

在发达国家，HCV感染率有所下降，但未来20年，因丙型肝炎导致的肝病死亡人数仍将继续增加[6]。基因型除对流行病学和HCV进化表征至关重要，对确定治疗方案亦同样重要。HCV基因型是影响疗效的重要因素之一[23]，若使用非泛基因型DAA方案，准确的基因型检测，采用个体化的DAA治疗方案，可提高治疗应答率，减少复发，同时减轻患者的经济负担。根据丙型肝炎流行病学特点，应加强HCV主要传播方式的健康宣教，提高对美容、口腔、中医治疗的消毒管理，减少因性接触、有创美容、牙科治疗及中医针灸等治疗造成的HCV感染；同时还应增强对静脉药瘾者的筛查与管理，并降低不同基因型重复感染的发生。因此，分析HCV基因型分布特点对临床治疗和不同传播途径的防控具有重要意义。