基于斑马鱼模型的西洋参提取物心脏保护作用研究

2020-02-26吕婧李晨杨龙飞高燕赵渤年

中国药房 2020年3期

关键词：斑马鱼西洋参间距

吕婧李晨杨龙飞高燕赵渤年

中图分类号 R285

文献标志码A

文章编号 1001-0408（2020）03-0308-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0q08.2020.03.11

摘要目的：研究西洋参提取物的心脏保护作用。方法：通过耐受性实验确定西洋参提取物的给药剂量以及特非那定的最优造模剂量后，将受精后24h（24hpf）的斑马鱼分为空白对照组（0.5%二甲基亚砜）、模型组（2.5μg/mL特非那定）、阳性对照组（2.5μg/mL特非那定+30μg/mL白藜芦醇）和不同质量浓度西洋参提取物组（2.5μg/mL特非那定+5、10、25μgmL西洋参提取物，以生药量计）;孵育48h后，以斑马鱼心率、心脏静脉窦一动脉球（SV-BA）间距为指标，并计算其心脏损伤修复率，以考察西洋参提取物的心脏保护作用。另取24hpf的斑马鱼分为空白对照组、模型组、阳性对照组和20批不同产地西洋参提取物组（5μg/mL，以生药量计），同法给药和孵育48h后，测定其心率、心脏SV-BA间距，并计算其心脏损伤修复率和心脏损伤相对修复率，进一步验证西洋参提取物的心脏保护作用。结果：与空白对照组比较，模型组斑马鱼心率显著降低（P<0.01），心脏SV-BA间距显著增大（P<0.01）;与模型组比较，阳性对照组和5、10、25μg/mL西洋参提取物组斑马鱼心率显著升高（P

关键词西洋参;斑马鱼;心脏保护;静脉窦一动脉球;间距;心率

西洋参为五加科植物西洋参（Panax quinquefoliumL.）的干燥根，其味甘、微苦，性凉，归心、肺、肾经n，，可补气养阴[2]，常用于治疗气虚阴亏型冠心病[3-4]。相关研究表明，西洋参通过益气养阴、和血来补益心气[5]，可改善冠心病患者经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后的胸闷、心悸、乏力等症状，提高患者生活质量[6]。但关于西洋参是否均具有心脏保护作用尚不明确，而且目前常用的心脏功能研究动物模型造模过程操作复杂，不便于进行在体的心脏结构及功能研究，也不适宜进行高通量药材心脏保护活性筛选。斑马鱼是国际认可的新型模式生物[7]，具有体型小、心脏发育周期全透明、繁殖周期短、产卵量大、发育迅速等优点[8]。基于此，本研究采用特非那定復制斑马鱼心脏损伤模型[9-10]，以心脏静脉窦一动脉球（SV-BA）间距为主要指标、心率为辅助指标探讨西洋参提取物的心脏保护作用，并进一步为西洋参提取物心脏保护作用谱一效相关质量评价系统的建立提供药效学基础。

l 材料

1.1 仪器

SPX-280B-G型光照培养箱（上海基星生物科技有限公司）;AGBP210S型电子天平（德国Sartorius公司）;Milli-QIQ7000型纯水机（美国Millipore公司）;KDM-A型控温电热套（金坛市医疗仪器厂）;GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱（上海博讯有限公司）;KQ2200DV型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;AXIO Zoom.V16型体式显微镜（德国Carl Zeiss公司）;FW-80型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

20批西洋参药材购自安徽省毫州市中药材交易市场，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定均为真品，其总皂苷含量均符合2015年版《中国药典》（一部）[1]规定;特非那定标准品、链酶蛋白酶E（北京索莱宝科技有限公司，批号：607A023、515S021，纯度：≥98%）;白藜芦醇标准品（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS000122，纯度：≥98%）;其他试剂均为市售分析纯，水为蒸馏水。20批西洋参样品信息见表1。

1.3 动物

野生型AB品系斑马鱼，雌雄兼有，由山东省科学院生物所提供。在专用的养殖房内，斑马鱼采用明暗交替方式饲养（光照14h后避光10h），循环水及环境温度控制为（28.0±0.5）℃，并按雌雄分缸饲养，每日饲喂丰年虾。

2 方法与结果

2.1 西洋参提取物母液的制备

取西洋参粉末（过三号筛）lg，精密称定，置于具塞圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定质量，加热回流提取2h，放冷，再次称质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干。干燥提取物以二甲基亚砜（DMSO）溶解，制成质量浓度为50mg/mL（以生药量计）的西洋参提取物母液，置于4℃冰箱中保存备用。给药前，取适量母液用蒸馏水稀释为所需质量浓度。

2.2 斑马鱼胚胎的收集

实验前将斑马鱼按雌雄比例1：1或1：2放置于产卵缸中，采用隔板将雌雄斑马鱼隔开，次日光照前抽离隔板，使雌雄斑马鱼自由受精。于抽离隔板时计时为0hpf（Hours post fertilization，受精后时间），抽离隔板后2h（2hpf）收集受精卵，置于清洁培养液中滴加适量亚甲基蓝溶液，放置于28℃恒温光照培养箱中孵育至24hpf。

2.3 斑马鱼对西洋参提取物的耐受性考察

将发育至24hpf的斑马鱼受精卵用1mg/mL的脱膜剂链酶蛋门酶E脱膜处理，体式显微镜下筛选发育正常的幼鱼，然后置于24孔板中，每孔10条。将实验分为不同质量浓度西洋参提取物组（1、5、10、25、50、100、200、400、800μg/mL，以生药量计）和空门对照组（0.5%DMSO），每组平行2孔（即每组20条斑马鱼样本）。加盖后将斑马鱼置于28℃恒温光照培养箱中孵育，每隔24h更换1次新鲜药液或DMSO。记录给药48h后斑马鱼幼鱼的死亡情况，计算其死亡率，并采用SPSS 23.O统计软件通过回归分析计算西洋参提取物的最低致死质量浓度，考察斑马鱼对西洋参提取物的耐受性。斑马鱼对西洋参提取物的耐受性考察结果见图1。

由图1可知，当西洋参提取物质量浓度≤50μg/mL时，斑马鱼幼鱼死亡率均为O;当西洋参提取物质量浓度≥100μg/mL时，斑马鱼幼鱼死亡率随着西洋参提取物质量浓度的增加而升高。回归分析结果显示，西洋参提取物的最低致死质量浓度为44.18μg/mL。为了保证实验过程中斑马鱼的正常存量，故将西洋参提取物的给药质量浓度设为5、10、25μg/mL（以生药量计）进行后续心脏保护作用研究。

2.4 特非那定对斑马鱼心脏形态的影响考察

将发育至24hpf的斑马鱼受精卵用1mg/mL链酶蛋门酶E脱膜后，体式显微镜下筛选发育正常的幼鱼，然后随机置于24孔板中，每孔10条。将实验分为不同质量浓度特非那定组（2、2.5、3、4μg/mL）和空门对照组（0.5% DMSO），每组平行2孔（即每组20条斑马鱼样本）。加盖后将斑马鱼置于28℃恒温光照培养箱中孵育48 h后，采用体式显微镜观察斑马鱼心脏部位的形态变化。采用Image Pro-plus 5.O软件测量斑马鱼心脏SV-BA间距，录像20s观察其心脏律动及血流情况，以此来筛选特非那定最优心脏损伤造模剂量。在每组20条斑马鱼样本中剔除死亡、畸形以及数据异常的斑马鱼样本，以每组11条斑马鱼为统计学分析样本量（n=ll），采用SPSS 23.O软件进行单因素方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。不同质量浓度特非那定对斑马鱼心脏损伤情况观察结果见图2，对斑马鱼心脏SV-BA间距的影响结果见表2。

结果显示，特非那定给药后引起了斑马鱼心脏损伤，包括心包水肿、血细胞在心房心室堆积、卵黄囊下出现明显淤血、心房心室律动不齐、血流速度减慢等现象，各质量浓度特非那定组斑马鱼心脏SV-BA间距均较空白对照组显著增大（P<0.05），并且以2.5μg/mL特非那定组最为明显，故最终选择特非那定的造模剂量为2.5μg/mL。

2.5 西洋参提取物对斑马鱼的心脏保护作用考察

将发育至24hpf的斑马鱼受精卵用1mg/mL链酶蛋白酶E脱膜后，体式显微镜下筛选发育正常的幼鱼，然后随机置于24孔板中，每孔10条。将实验分为空门对照组（0.5% DMSO）、模型组、阳性对照组（门藜芦醇30μg/mL）[10-11]和西洋参提取物组（样品批号：20180185，10、25μg/mL，以生药量计），每组平行2孔（即每组20条斑马鱼样本）。除空门对照组外，其余各组均按“2.4”项下方法添加2.5μg/mL特非那定，加盖后将斑马鱼置于28℃恒温光照培养箱中孵育48h后，采用体式显微镜观察斑马鱼心脏部位的形态变化，录像20s观察其心脏律动及血流情况。采用Image Pro-plus 5.O软件测量斑马鱼SV-BA间距，并对录像中斑马鱼心跳进行计数以推算其心率，同时计算斑马鱼心脏损伤修复率[心脏损伤修复率（%）=（给药组斑马鱼心脏SV-BA间距-模型组斑马鱼心脏SV-BA间距）/（空白对照组斑马鱼SV-BA间距一模型组斑马鱼SV-BA间距）Xl00%]。统计分析方法同“2.4”项下。各组斑马鱼心脏损伤情况观察结果见图3，心率测定结果见表3，心脏SV-BA间距、心脏损伤修复率测定结果见表4。

结果显示，模型组斑马鱼出现了明显的心脏损伤症状，表现为心包水肿、卵黄囊下淤血、心房心室律动不齐、血流速度减慢等;阳性对照组及西洋参提取物各给药组斑马鱼心包水肿和卵黄囊下淤血减轻，心房心室律动趋近整齐，血流速度恢复正常。与空白对照组比较，模型组斑马鱼心率显著降低（P<0.01），心脏SV-BA间距显著增大（P<0.01），说明特非那定造成了斑马鱼心脏损伤。与模型组比较，阳性对照组和5、10、25μg/mL西洋参提取物组斑马鱼心率显著升高（P<0.01），阳性对照组和5、10μg/mL西洋参提取物组斑马鱼心脏SV-BA间距显著缩短（P<0.05或P

2.6 20批不同产地西洋参提取物对特非那定所致斑马鱼心脏损伤的保护作用考察

将发育至24hpf的斑马鱼受精卵用1mg/mL链酶蛋门酶E脱膜后，在体式显微镜下筛选发育正常的幼鱼，然后随机置于24孔板中，每孔10条。将实验分为空白对照组（0.5% DMSO）、模型组、阳性对照组和20批不同产地西洋参提取物组（质量浓度均为5μg/mL，以生药量计），每组设2个复孔（即每组20条斑马鱼样本）。除空白对照组外，其余各组均按“2.5”项下方法加入2.5μg/mL特非那定孵育和相应指标检测及统计分析外，同时计算西洋参提取物组较阳性对照组的心脏损伤相对修复率[心脏损伤相对修复率（%）=西洋参提取物组斑马鱼心脏损伤修复率/阳性对照组斑马鱼心脏损伤修复率×100%]。验证实验中各组斑马鱼心率、心脏SV-BA间距、心脏损伤修复率及心脏损伤相对修复率测定结果见表5（图略）。

结果显示，模型组斑鱼表现出了上述心脏损伤症状;阳性对照组和20批不同产地西洋参提取物组斑马鱼以上症状均明显减轻甚至恢复正常。与空白对照组比较，模型组斑马鱼心率显著降低，心脏SV-BA间距显著增大（P<0.01），说明特非那定造成了斑马鱼心脏损伤。与模型组比较，阳性对照组和20批西洋参提取物组斑马鱼心率均显著升高，心脏SV-BA间距均显著缩短（P<0.01）。通过分析20批西洋参提取物组心脏损伤相对修复率数值可知，由于西洋參的产地及批次不同，所以20批西洋参提取物对斑马鱼心率及心脏SV-BA间距改善作用略有不同，但心脏损伤相对修复率在75.48%～98.12%之间，说明各产地的西洋参提取物均具有一定的心脏保护作用。其中，以批号为2018006的西洋参提取物的心脏保护作用最优，其心脏损伤相对修复率达98.12%。

3 讨论

斑马鱼心脏静脉窦是血液进入心房的部位，动脉球是血液流出心室的部位，心脏SV-BA间距最能反映其心脏损伤程度;另外，斑马鱼的心率反映了心脏的泵血功能[11-12]。所以，本研究选用斑马鱼心脏SV-BA间距为主要指标、心率为辅助指标，考察西洋参提取物对斑马鱼心脏损伤的保护作用。

研究显示，目前具有明确的心脏保护作用或常用于治疗由毒副反应引起的心脏损伤的药物有右丙亚胺、复方丹参滴丸、白藜芦醇等[13]。其中，右丙亚胺作为美国FDA的批准药物，因价格昂贵，极大地限制了其应用。白藜芦醇作为一种抗氧化剂[14]，对冠心病、缺血性心脏病具有防治作用[15-16];尤其在斑马鱼心脏损伤/保护的研究领域中，考虑到斑马鱼独特的透皮吸收給药方式，白藜芦醇常用作斑马鱼心脏保护药来改善毒副反应引发的心脏损伤[17]。由于复方丹参滴丸独特的质地不适于斑马鱼给药，所以在前期研究中，笔者比较了丹参原药材、含有丹参提取物的丹红注射液以及白藜芦醇对斑马鱼的心脏保护作用。结果发现丹参及丹红注射液主要通过促进斑马鱼血管生成、扩张血管等作用减轻心脏损伤;而白藜芦醇可改善斑马鱼心脏SV-BA间距、心率及血流情况，具有直接的心脏保护作用，并且其心脏保护的作用途径与西洋参提取物类似，这更有利于作为对照物研究西洋参提取物心脏保护作用机制和作用靶点，故本研究最终选择白藜芦醇作为阳性对照药。

在本研究中，2.5μg/mL的特非那定可明显造成斑马鱼心脏损伤。阳性对照药白藜芦醇和5、10、25μg/mL的西洋参提取物作用后，斑马鱼心脏损伤情况均不同程度地改善，其心包水肿和卵黄囊下淤血减轻、血流速度恢复正常、心脏SV-BA间距显著缩短、心率显著升高，并且以5μg/mL西洋参提取物作用后效果最为明显（心脏损伤修复率为73.77%）。在验证实验中，由于用于实验研究的西洋参产地、批次较多，不可能通过1次实验就完成验证，而每次实验用于配对产卵的斑马鱼存在个体差异，这导致了所产的鱼卵状态不同，对同一质量浓度的同一种药物反应也不同，故心脏SV-BA间距及心率测量值也会有一定差异。所以为了减少斑马鱼个体误差及操作误差，在参考相关文献[10-11]后，针对多批次西洋参提取物心脏保护作用的评价，本研究以每次实验中阳性对照组斑马鱼心脏损伤修复率作为参比，计算心脏损伤相对修复率作为西洋参提取物心脏保护药效评价指标，实现高通量药材药效评价的目的。本研究结果显示，20批西洋参提取物（5μg/mL，以生药量计）对斑马鱼的心脏损伤相对修复率在75.48%～98.12%之间，提示其均具有一定的心脏保护作用。

综上所述，本研究利用斑马鱼模型，以心脏SV-BA间距为主要指标、心率为辅助指标，证实了西洋参提取物具有一定的心脏保护作用，且方法稳定、结果可靠。但是西洋提取物心脏保护的药效物质基础及西洋参提取物心脏保护作用的谱一效关系还有待进一步研究。

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