花蕾型忍冬新种质组培技术研究

2020-02-25曾慧杰王晓明李永欣乔中全刘思思王湘莹

湖南林业科技 2020年1期

曾慧杰，蔡能，王晓明，李永欣，乔中全，刘思思，陈艺，王湘莹

(1.湖南省林业科学院，湖南长沙 410004； 2.林木无性系育种湖南省重点实验室，湖南长沙 410004)

忍冬科忍冬属植物忍冬L.japonicaThunb是我国传统药材金银花的药源植物[1]，应用历史悠久[2]，在制药、香料、保健食品、饮料、化妆品等领域被广泛应用[3]。目前我国栽培的忍冬品种均为花冠开裂的品种，作者在山东进行忍冬种质资源调查时，发现了花冠不开裂的花蕾型忍冬新种质，与现在栽培种相比，具有花蕾期长、采摘方便、产量高等优良特性，开发利用前景广阔。因此，对该种质的高效繁育技术进行研究，以期加快其推广利用。

忍冬植物的繁殖多采用扦插、嫁接和组培方式，其中组织培养具有繁殖速度快，增殖系数高，不受季节、气候、环境等条件限制，可全年生产的特点[4]。目前市场栽种的‘金丰1号’[5]、‘蒙花’[6-7]、‘中花1号’[8]、‘九丰1号’[9]、‘金花3号’[10]和‘花瑶晚熟’[11]等忍冬品种已有开展组培研究的报道；忍冬植物的叶片作为外植体可诱导形成愈伤组织[12-13]，Kim[14]用日本金银花的合子胚为材料，开展了体胚发生和植株再生研究，Wang等[15]诱导出了金银花‘金翠蕾’的体胚。这些研究在忍冬植物的组培方面取得了一定进展，为一些品种苗木的快繁提供了技术支撑。但忍冬植物的组培具有较强的品种差异性，针对新发现的花蕾型忍冬新种质，还需要研究与其相适宜的组培技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料参试的花蕾型忍冬材料种植在湖南省林业科学院试验林场的忍冬种质资源圃。从健康植株的当年新生枝条上剪取嫩枝，要求长势旺，无破损和病虫害，嫩枝采集后，用冰袋低温保湿带回实验室，去除叶片，保留叶柄，利用顶端5～6 cm的枝条作为外植体材料。

1.1.2 植物激素 6-BA(6-苄氨基嘌呤)、NAA(萘乙酸)、ABT6(生根粉6号)、IAA(吲哚丁酸)、IBA(吲哚丁酸)和KIBA(吲哚丁酸钾盐)等植物激素购自上海国药集团。

1.1.3 试验设备超净工作台：SW-CJ-1FD (中国)；超纯水系统：MILLIPORG MILLI-Q DIRECT 8(美国)。

1.2 试验设计

1.2.1 继代培养外植体接种到培养基后，选取萌芽的外植体材料进行继代培养。

(1) 设计了MS、3/4MS、DKW、N6共4种培养基，每种培养基分别添加BA0.5+NAA0.1+蔗糖40 g·L-1，以筛选适宜的继代培养基。

(2) 试验筛选出的优势基本培养基，分别添加BA和NAA植物激素，研究其对继代增殖的影响。①设置4种BA的浓度水平，分别为0.3、0.5、1.0、1.5 mg·L-1，研究BA浓度对组培苗增殖的影响；NAA浓度固定为0.1 mg·L-1。②设置4种NAA的浓度水平，分别为0.05、0.1、0.2、0.3 mg·L-1，研究NAA浓度对组培苗增殖的影响；BA浓度固定为1.0 mg·L-1。

1.2.2 生根培养从组培苗上分别剪取3.0～3.5 cm长的小苗，转接到生根培养基上进行生根培养；以1/2MS为基本生根培养基，添加活性炭150 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1；共设计了6种浓度的IBA处理，分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1。

1.2.3 组培试验调查

(1) 继代培养调查：每个处理接种10瓶，每瓶接种3个基本一致的外植体，3个重复；培养30 d后，调查忍冬组培苗增殖系数等生长情况指标。

(2) 生根培养调查：每个处理接种10瓶，每瓶接种组培苗5株，试验重复3次。培养25 d后，调查组培苗根系情况。

1.3 试验方法

1.3.1 外植体消毒试验材料在超净工作台上进行消毒处理。对茎段外植体进行消毒，将其切取成带节茎段，每段长2～3 cm，茎段先用75%酒精浸泡漂洗10～25 s，再无菌水冲洗3～4次，然后投入到加有2～3滴吐温80(浓度0.1%)的升汞溶液中，浸泡3～5 min，最后用无菌水冲洗4～5次，沥干备用。

1.3.2 外植体接种将消毒后茎段外植体，剪取成1～1.5 cm长的带芽茎段，腋芽朝上，芽上部分稍短一些，芽下茎节要插入培养基，须稍长一些；将下部切出新茬口的茎段，接种到启动培养基MS上。

1.3.3 培养基制备培养基的卡拉胶用量为8.0 g·L-1，蔗糖浓度为30～40 g·L-1，添加相应的植物激素后，将pH值调至5.8；培养基用玻璃瓶分装，每瓶35～40 mL，封盖后用高压蒸汽灭菌锅灭菌20 min，温度121 ℃，压力1.1 kg·cm-2。

1.3.4 培养条件继代培养和生根培养的培养环境条件宜培养温度为(25±2)℃，光照强度为1500～2 000 lx，光照时间为每天12 h。

1.3.5 数据分析试验数据的平均值、标准差的制作，采用Excel 2007软件按常规数理统计方法汁算分析；数据多重比较用SPSS 19.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 花蕾型忍冬新种质组培继代培养

2.1.1 基本培养基对组培苗继代的影响外植体在MS启动培养基上培养一段时间后，逐步出现植株叶色有转黄的趋势，并有部分枯叶和死苗的现象，因此，本研究调整了基本培养基设计，以筛选能保持该忍冬新种质组培苗旺盛生长的基本培养基。

由表1可知，在4种基本培养基3/4MS、MS、N6、DKW上，继代培养的植株的存活率分别为78.9%、82.2%、51.1%、93.3%，前三种培养基均出现了叶片发黄的现象，其中N6表现得最为严重，而且叶片也有耷拉下垂的问题，平均株高也最低，仅1.85 cm；而效果最好的处理是DKW培养基，不仅存活率最高，平均株高最长，植株长势也较旺，叶色嫩绿，叶片舒展。

2.1.2 激素浓度对继代增殖的影响

(1) BA浓度对组培苗增殖的影响

由表2可知，在DKW培养基的基础上，不同浓度的BA对该忍冬新种质组培苗的增殖效果和生长产生了显著影响。当BA浓度在0～1.0 mg·L-1的范围内时，对繁殖系数和不定芽长度的影响表现出相似性规律，均是随着BA浓度的升高而增加，但BA浓度超过1.0 mg·L-1后，增殖系数和不定芽长度又呈下降趋势。因此，在该忍冬新种质继代增殖培养过程中，BA适合的浓度是1.0 mg·L-1。

表2 BA浓度对组培苗增殖的影响Tab.2 The effect of BA concentration on proliferation of tissue culture seedlingsBA浓度/(mg·L-1)增殖系数不定芽长度/cm0.32.13±0.26 c1.96±0.16 b0.53.06±0.29 b2.35±0.27 a1.04.95±0.54 a2.64±0.31 a1.53.38±0.36 b1.58±0.11 c 注:表中数据均为平均值及标准差,不同的小写字母表示差异显著。

(2) NAA浓度对组培苗增殖的影响

由表3可知，在DKW培养基的基础上，当BA浓度保持在1.0 mg·L-1时，NAA浓度与增殖系数呈负相关，随着NAA浓度的升高，增殖系数却逐渐降低，当NAA浓度为0.05 mg·L-1时，增殖系数最大值为4.86，其次是浓度为0.1 mg·L-1时，增殖系数为4.74，当NAA浓度达到0.3mg·L-1时，增殖系数最小为3.27。

表3 NAA浓度对组培苗增殖的影响Tab.3 The effect of NAA concentration on proliferation of tissue culture seedlingsNAA浓度/(mg·L-1)增殖系数不定芽长度/cm0.054.86±0.47 a1.75±0.16 c 0.14.74±0.52 a2.24±0.26 ab0.24.26±0.39 b2.48±0.28 a 0.33.27±0.35 c2.12±0.19 b 注:表中数据均为平均值及标准差,不同的小写字母表示差异显著。

就不定芽长度而言，当NAA浓度为0.2 mg·L-1时，不定芽的平均长度最长为2.48 cm，排第二是当NAA浓度为0.1 mg·L-1时，不定芽长2.24 cm；而当NAA浓度为0.05 mg·L-1的处理时，虽然增殖系数最高，但不定芽最短，仅1.75 cm。平衡考虑增殖系数与不定芽两个方面，在增殖培养中，NAA较适宜的浓度是0.1 mg·L-1。

可见适宜该忍冬种质继代培养的培养基为：DKW+BA1.0+NAA0.1+蔗糖40 g·L-1，增殖系数4.7。

2.2 花蕾型忍冬新种质组培生根培养

由表4可知，IBA浓度对忍冬新种质组培苗生根的影响显著，随着IBA浓度的上升，生根率、平均根数、平均根长均呈“上升-下降”的变化趋势；其中，不添加IBA时，生根率为0，生根情况最好的是IBA浓度为3.0 mg·L-1的处理，生根率96.5%，平均根数4.6条，平均根长2.73 cm，均显著高于其他处理。该忍冬新种质适宜的生根培养基为：1/2MS+IBA3.0+活性炭150 mg·L-1，生根率96.5%。

表4 IBA浓度对组培苗生根影响Tab.4 The effect of IBA concentration on of rooting cul-ture of tissue culture seedlingsIBA浓度/(mg·L-1)生根率/%平均根数/条平均根长/cm0 0001.065.42.420.952.088.34.181.963.096.54.612.734.084.74.091.575.070.23.111.48