杨 媚,杨 泰,陈凤鸣,马 杰,陈清华

(湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharide，ABP)是从中草药牛膝中提取的一种生物活性多糖，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降血糖等广泛的生物学功能，被视为可以替代抗生素的天然添加剂，已作为免疫增强剂在动物生产中广泛使用[1-4]。研究表明，ABP最主要的活性是其免疫调节活性，其对机体的特异性和非特异性免疫功能均具有增强作用，主要体现在能够通过促进特异性抗体生成、促进淋巴细胞增殖、提高巨噬细胞系统的吞噬能力、诱导细胞因子的分泌和激活补体系统等方式提高机体的免疫功能[5-8]。此前，对ABP免疫调控功能作用原理的研究报道多集中且局限于细胞水平[9-10]。本试验采用ABP联合猪瘟疫苗免疫猪只，观察ABP对猪瘟疫苗的免疫增强作用和对血常规指标的影响，为ABP提高猪瘟疫苗的作用效果及安全应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及设计选择25日龄健康三元杂交(杜洛克×长白×大约克)去势断奶仔猪40头，随机分为4组，分别为灌胃高(ABPH)、中(ABPM)、低(ABPL)ABP剂量组和对照组(C)，每组10头。试验期为28 d，试验设计与处理见表1。28日龄时，颈部肌肉注射猪瘟疫苗1.0 mL。参考课题组前期体外试验研究结果[11]，免疫前3 d和免疫后3 d按表1给药，每日分3次对仔猪进行灌胃。各组分别在免疫后0，7，14，21，28 d，每组随机抽取 5头仔猪采血，测定猪瘟抗体效价和血常规指标。

表1 试验设计

1.2 疫苗猪瘟ST细胞系活疫苗，广东永顺生物制药股份有限公司生产，使用时用灭菌生理盐水稀释成1头份/mL。

1.3 猪瘟抗体效价和血常规指标测定各组仔猪分别在免疫后0,7,14,21,28 d，每组随机抽取5头仔猪进行前腔静脉采血，用真空采血管采血5 mL，4℃，3 000 r/min离心15 min分离出血清，用于猪瘟抗体效价检测。同时用EDTA抗凝采血管采血2 mL，用于血常规指标测定。猪瘟抗体检测试剂盒兰州兽医研究所生产；血常规指标检测利用全自动血细胞仪进行检测。

1.4 数据处理与分析试验数据经Microsoft Excel初步处理后，使用SPSS 20.0统计分析软件进行单因素方差分析(One-ANOVA)，以平均值±标准差表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ABP对猪瘟疫苗免疫仔猪猪瘟抗体效价的影响由表2可知，免疫后7,14,21 d，添加ABP的试验组抗体效价显著高于对照组(P<0.05)，其中ABPM的抗体效价最高；免疫后28 d，ABPL与C组的抗体效价无显著性差异(P>0.05)，ABPH与ABPM的抗体效价显著高于ABPL和C组(P<0.05)，ABPH与ABPM间的抗体效价无显著性差异(P>0.05)，其中ABPM的抗体效价最高。

表2 ABP对猪瘟疫苗免疫仔猪猪瘟抗体效价的影响(log2)

2.2 ABP对猪瘟疫苗免疫仔猪血常规指标的影响由表3,4可知，免疫后不同时间点，添加ABP的试验组与C组的红细胞数及中性粒细胞比例均差异不显著(P>0.05)。由表5可知，免疫后7 d，ABPL组的白细胞数显著低于C、ABPH和ABPM组(P<0.05)，且C、ABPH和ABPM组间无显著性差异(P>0.05)，其中ABPM组的白细胞数最高；免疫后14，21 d，ABPH、ABPM组白细胞数显著高于C组和ABPL组(P<0.05)，且ABPH、ABPM组间无显著性差异(P>0.05)；免疫后28 d，ABPM组的白细胞数量显著高于C、ABPH和ABPL组(P<0.05)。由表6可知，免疫后7 d，ABPH组的淋巴细胞比例显著高于ABPL、C组(P<0.05)，ABPH组与ABPM组无显著性差异(P>0.05)，其中ABPH组的淋巴细胞比例最高；免疫后14，21 d，ABPH、ABPL组显著高于C组(P<0.05)，ABPH、ABPL组与ABPM组间无显著性差异(P>0.05)，其中ABPL组的淋巴细胞比例最高；免疫后28 d，各组间差异均不显著(P>0.05)。

表3 ABP对猪瘟疫苗免疫仔猪红细胞数的影响 1012/L

表4 ABP对猪瘟疫苗免疫仔猪中性粒细胞比例的影响 %

表5 ABP对猪瘟疫苗免疫仔猪白细胞数的影响 109/L

3 讨论

植物多糖在促进巨噬细胞作用时，多表现为增强巨噬细胞的吞噬能力，并释放NO及各种细胞因子来调节树突状细胞及巨噬细胞，激活先天性免疫及适应性免疫，增强机体的免疫力[12-14]。一系列试验研究发现，ABP增强仔猪免疫功能明显强于促生长性能[15]。与此同时，通过研究ABP对树突状细胞(DC)成熟影响的结果表明，ABP能促进小鼠骨髓来源性DC的分化、成熟，提高DC表面分子的表达，促进DC的抗原递呈能力提升[16-17]。体液免疫是由B淋巴细胞介导的一种特异性免疫反应，机体外周血中的抗体水平是衡量体液免疫功能的重要标志[18]。猪瘟抗体水平是反映猪瘟疫苗免疫后仔猪特异性免疫功能的指标。刘永华等[19]研究发现，给禽流感灭活苗免疫的雏鸡注射0.5 mL质量浓度为4或8 g/L的ABP均能够显著提高其免疫器官指数和禽流感血凝抑制抗体的滴度，进而提高禽流感灭活苗的免疫效果。邱妍等[20]用黄芪多糖、板蓝根多糖、ABP和山药多糖溶液对新城疫弱毒苗免疫的蛋公鸡进行肌肉注射，结果表明,4种多糖均能显著提高新城疫抗体效价,促进外周血T淋巴细胞增殖，并有一定的剂量和时效关系。CHEN等[21]研究证明，ABP可通过提高血清抗体和补体水平，增强细胞和体液免疫，还可通过增强体外培养的淋巴细胞增殖活性、促进细胞因子的产生，进而提高断奶仔猪的免疫力，ABP具有剂量依赖性的免疫调节活性，而1 500 mg/kg 的剂量在断奶仔猪体内具有最好的效果。CD4+T细胞通过产生细胞因子来控制对疟原虫的细胞免疫应答，CD4+T细胞产生的促炎性(Th1)和抗炎性(Th2)细胞因子在疟疾感染的结果中起决定性作用，早期的促炎性细胞因子反应介导保护性免疫[22]。多数中药多糖通过调节巨噬细胞及树突状细胞的免疫活性最终起到对机体的免疫调节作用[23-24]。ZHU等[25]用ABP对疟原虫进行预处理，结果发现ABP预处理促进了树突状细胞的成熟，选择性增强Th1的免疫应答，激活小鼠抗疟疾血液阶段感染的免疫反应，以控制疟原虫的增殖，并延长了感染小鼠的存活期。与上述研究结果一致，本试验结果表示，ABP可增强仔猪的特异性免疫应答反应，提高血清抗体水平，进而提升猪瘟疫苗的免疫效力，其中3 000 mg·头-1·d-1对仔猪进行灌胃效果最佳。

白细胞是一个庞大的血细胞家族，在机体损伤治愈、抗御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用，当机体发生炎症或其他疾病时都可引起白细胞总数及各种白细胞的百分比发生变化[26]。刘玉兰等[27]发现LPS刺激显著降低断奶仔猪血液中白细胞和淋巴细胞数量，诱导仔猪产生急性细菌感染症状，而注射ABP提高了血液中白细胞数量、中性粒细胞数量及比例，表明ABP有一定的改善免疫，抵御炎症的作用。本试验中免疫后14,21 d，ABPH、ABPM组白细胞数显著高于C组和ABPL组，且ABPH、ABPM组间无显著性差异；免疫后28 d，ABPM组的白细胞数量显著高于C、ABPH和ABPL组；说明ABP可提高血清白细胞数量，增强机体免疫力。

淋巴细胞增殖是机体免疫系统受到外来抗原刺激后产生的正常保护性生理反应，淋巴细胞的增殖和分化是免疫应答中的一个重要环节，淋巴细胞的数量与亚群的变化对机体免疫状态有一定的提示作用[28]。淋巴细胞增殖率可以作为测定机体免疫功能的指标之一，其高低可反映机体的细胞免疫水平[29]。ABP对外周血淋巴细胞增殖有促进作用，可显著促进T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖[30-31]。陈春[10]在ABP对猪外周血淋巴细胞增殖的研究中发现，不同浓度的ABP均能促进猪外周血淋巴细胞的增殖，且有一定的剂量依赖关系。本试验中，免疫后7,14,21 d，ABP对淋巴细胞的比例影响显著。这可能是ABP促进了免疫器官的发育成熟，对淋巴细胞的生成起到了一定的促进作用。

本试验条件下，ABP作为免疫增强剂可联合猪瘟疫苗显著提高抗体水平、白细胞数量和淋巴细胞比例，增强猪瘟疫苗的免疫效力，提高仔猪免疫力，其中3 000 mg·头-1·d-1的剂量对免疫仔猪进行灌胃效果最佳。