樊琛 曾庆华 李燕 王会 孙小凡 梁荣 郭兴峰 郑焕芹 冯成成

摘要：为了探讨石榴果皮废物资源化利用及其类黄酮抗自由基能力，以石榴果皮为原料，探讨超声次数、提取时间、温度、料液比及乙醇体积分数对石榴果皮中类黄酮提取效果的影响。NKA-2大孔树脂纯化类黄酮提取物，以IC50为指标检测纯化物清除羟自由基、超氧自由基、2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS+·）及1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）的能力，并与维生素C抗自由基能力比较。结果表明，石榴果皮提取类黄酮的最佳条件为超声10次，持续时间5 s/次，浸提温度65 ℃，乙醇体积分数35%，浸提时间4 h，料液比1 g ∶ 60 mL，类黄酮提取量为21.34 mg/g。类黄酮纯化物清除上述4种自由基的IC50分别为1.22 mg/mL、0.061 mg/mL、0.16 mg/mL、1.37 μg/mL，与维生素C的IC50（0.87 mg/mL、0.094 mg/mL、0.07 mg/mL、2.88 μg/mL）接近。由此可见，石榴果皮可作为类黄酮提取原料，提高石榴果皮废物资源化利用。

关键词：石榴果皮;类黄酮;自由基

中图分类号： R282  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）23-0200-04

石榴是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的果实，在山东、江苏、河南等地皆有种植，其果实营养丰富。研究表明，石榴汁或其提取物能够有效清除多种自由基，对动脉粥样硬化、肿瘤、糖尿病、细菌感染等均具有一定的防治作用[1-3]。但石榴果皮（包括外果皮、中果皮、内果皮）作为废弃物，浪费较大。石榴果皮厚2～4 mm，质量占45%～48%。石榴果皮主要活性成分有鞣质、类黄酮、有机酸及生物碱等[3]。石榴果皮中的类黄酮化合物具有抗氧化活性[3-6]。因此，本试验以石榴果皮为材料，采用单因素试验与L9（34）正交试验，探讨石榴果皮中类黄酮提取工艺，并以NKA-2型大孔树脂纯化粗提物提取量，检测石榴果皮类黄酮纯化物抗羟自由基（·OH）、超氧自由基、2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS+·）和1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）的能力，旨在提高石榴果皮中类黄酮的提取量，并为类黄酮的提取和石榴产业深开发提供新的途径，实现废物资源化利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 新鲜、完整的石榴，2018年10月购于山东聊城当地市场。于聊城大学食品科学实验室去除石榴籽后，55 ℃烘干至恒质量，粉碎过筛。

1.1.2 试验试剂 无水乙醇、盐酸、水杨酸、EDTA、硫酸亚铁、Tris、邻苯三酚、2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS+·）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、浓硫酸等，均为分析纯。

1.1.3 试验仪器 UV-1800型紫外可见分光光度计，购自上海美谱达仪器有限公司;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，购自宁波新艺超声设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 类黄酮的测定 以芸香苷为标准样品，络合-分光光度计法测定类黄酮含量并绘制标准曲线[4-7]。准确吸取 0.5 mL 提取液并稀释至 5 mL，按标准曲线步骤测定吸光度，查标准曲线后计算样液的类黄酮含量[4-7]。

1.2.2 各因素对类黄酮提取量的影响 （1）超声次数。称取0.4 g石榴皮粉末，在料液比1 g ∶ 40 mL、60%乙醇条件下分别超声（150 W）5、10、20、30、40次，持续时间5 s/次，40 ℃提取3 h，过滤定容至 25 mL，测定类黄酮含量。

（2）料液比。量取60%乙醇溶液20 mL，按料液比1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 60 mL加入样品，超声10次后 40 ℃ 提取3 h，过滤定容至 25 mL，测定类黄酮含量。

（3）乙醇体积分数。称取0.4 g样品，按料液比1 g ∶ 40 mL分别加入0、15%、30%、45%、60%、75%、90%乙醇，超声10次后40 ℃提取3 h，过滤定容至25 mL，测定类黄酮含量。

（4）提取时间。称取0.4 g样品，料液比 1 g ∶ 40 mL 加入60%乙醇，超声10次后40 ℃分别提取20 min、1 h、3 h、6 h、12 h、18 h，过滤定容至 25 mL，测定类黄酮含量。

（5）提取温度。称取0.4 g样品，按料液比 1 g ∶ 40 mL 加入60%乙醇水溶液，超声10次后分别在30、40、50、60、80 ℃下浸提3 h，过滤定容至 25 mL，测定类黄酮含量。

（6）正交试验。在单因素试验基础上，进行提取温度、料液比、乙醇体积分数、提取时间的L9（34）正交试验，以提取液类黄酮含量为指标，确定提取石榴果皮类黄酮的最佳工艺[4-7]。

1.2.3 类黄酮的纯化 经预处理的NKA-2型大孔树脂静态分离纯化石榴皮类黄酮，45 ℃恒温振荡 21 h吸附，60%乙醇于 25 ℃恒温振荡24 h解吸附，获得石榴果皮类黄酮纯化液[8-9]。

1.2.4 抗自由基检测 （1）抗羟自由基。0.4 mL 0.15 mol/L FeSO4、2.0 mL 2 mmol/L水杨酸、1.0 mL 6 mmol/L H2O2以及样液1.0 mL;对照以蒸馏水代替样液。加入H2O2后37 ℃水浴1 h，测 510 nm 处的吸光度，计算清除率[6，10]。

式中：D1为试验组吸光度;D0为对照组吸光度。

（2）抗超氧阴离子自由基。A液：pH值为8.20的0.1 mol/L Tris-HCl緩冲溶液。B液：4.5 mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液。25 ℃依次加入A液2.35 mL、1.00 mL蒸馏水、1.00 mL样液及 0.15 mL B液于比色管中，立刻测定325 nm初始吸光度，1 min后再次测定吸光度。对照以蒸馏水代替样液。计算清除率[11-12]。

式中：ΔD0为对照组吸光度差值;ΔD1为试验组吸光度差值。

（3）抗ABTS自由基。待测液2 mL加入7 mL ABTS标准工作液振荡摇匀，常温避光10 min后测吸光度D1。同时做对照测吸光度D0，计算清除率[13]。

式中：D1为试验组吸光度;D0为对照组吸光度。

（4）抗DPPH自由基。待测液2 mL加入2 mL DPPH溶液振荡摇匀，密封避光30 min，517 nm测吸光度D1。同时做对照测吸光度D0，计算清除率[13-15]。

式中：D1为试验组吸光度;D0为对照组吸光度。

1.3 数据统计与分析

类黄酮提取优化结果以正交设计助手v3.1分析。

2 结果与分析

2.1 芸香苷标准曲线

由图1可知，回归方程：y=12.617x+0.009 6，r2=0.998 1。式中：y为吸光度;x为质量体积浓度，mg/mL。

2.2 不同因素对石榴果皮类黄酮提取量的影响

2.2.1 超声次数的影响 由图2可知，随超声次数增加，石榴果皮中类黄酮提取量先增加后降低。超声次数为10次时，提取量最高。超声时间过长可能会破坏类黄酮，因此后续试验均采用超声10次，持续时间5 s/次。

2.2.2 料液比的影响 由图3可知，类黄酮提取量随溶剂的比例增大而增高，但在1 g ∶ 60 mL之后增高不明显，考虑节省成本，选择料液比为1 g ∶ 50 mL～1 g ∶ 70 mL 进行正交试验。

2.2.3 浸提时间的影响 由图4可知，类黄酮的提取量随浸提时间的延长先升高后下降，3 h时最高。由此推测，浸提时间过长，导致部分类黄酮分解。因此，选择2～4 h进行正交试验。

2.2.4 浸提温度的影响 由图5可知，隨浸提温度增加，类黄酮提取量先增加后降低。当浸提温度为60 ℃时，类黄酮提取量最高。提高浸提温度有助于类黄酮物质溶出，但温度过高可能破坏类黄酮结构，且对溶剂极性有影响，因此选择55～65 ℃进行正交试验。

2.2.5 乙醇体积分数的影响 由图6可知，随乙醇体积分数增加，类黄酮提取量先增加后降低，在30%时达到最高。因此选择25%～35%乙醇体积分数进行正交试验。

2.3 正交试验及验证结果

采用L9（34）正交试验确定石榴果皮中类黄酮的最佳提取工艺。由表1可知，4个因素对石榴果皮类黄酮提取影响的强弱依次为浸提温度>乙醇体积分数>浸提时间>料液比，根据均值确定最佳提取工艺为C3A3D3B2，即最优提取条件为浸提温度65 ℃、乙醇体积分数35%、浸提时间4 h、料液比 1 g ∶ 60 mL。经验证试验，在此条件下，类黄酮提取量平均值为21.34 mg/g，优于正交试验中所有组合。

2.4 石榴果皮类黄酮对4种自由基的清除能力

将NKA-2型大孔树脂纯化的类黄酮溶液及维生素C溶液分别逐级稀释，测定其对·OH、超氧自由基、ABTS+·、DPPH·的清除能力，计算自由基清除IC50。类黄酮纯化物与维生素C抗自由基IC50比较，见表2。

由表2可知，石榴果皮中类黄酮纯化物对羟自由基、超氧自由基、ABTS+·、DPPH·均具有清除能力。其中，类黄酮纯化物对羟自由基、ABTS+·的清除能力略小于维生素C，纯化物对超氧自由基、DPPH·的清除能力略强于维生素C。但总体而言，石榴果皮中类黄酮纯化物的抗自由基与强抗氧化剂维生素C十分接近。石榴果皮类黄酮纯化物对4种自由基的清除能力大小依次为DPPH·、 O-2 ·  、ABTS+·、·OH。

3 讨论与结论

宋薇薇在对石榴外果皮总黄酮的提取试验中采用乙醇提取微波辅助法，得出最佳提取工艺条件为乙醇体积分数90%、微波功率140 W、提取时间60 s、料液比1 g ∶ 15 mL，此时总黄酮得率为（6.64±0.032）%[3]。本试验选用超声辅助提取，试验材料石榴果皮选用的是外果皮和中果皮，最佳提取条件下的类黄酮提取量为21.34 mg/g。获得的类黄酮提取效率低于宋薇薇微波辅助法的提取效率。植物因不同品种、不同产地、不同部位，其生理活性物质含量有所差异。由此推测，不同辅助预处理方式、石榴的产地、品种、选用部位等均会对石榴皮中类黄酮含量及类黄酮提取效率产生影响。石榴果皮全果皮或仅选用外果皮，类黄酮含量有差异，外果皮的类黄酮含量通常高于中果皮。本试验选用的材料包含外果皮和中果皮，有资料显示，不同石榴品种、不同部位对类黄酮提取物抗自由基能力存在差别。如云南玉溪产地的酸石榴其 DPPH·清除率的IC50 可达到0.005 mg/mL。本试验中采用山东聊城产的石榴，其类黄酮纯化物清除DPPH·的IC50为 1.37 μg/mL，略强于云南玉溪产石榴。本试验检测了石榴果皮类黄酮对4种自由基的清除能力，石榴果皮的类黄酮纯化物对羟自由基、超氧自由基、ABTS+·、DPPH·均具有清除能力，且与强抗氧化剂维生素C十分接近。笔者曾检测玫瑰花苞浸出液的抗自由基能力，结果表明玫瑰花苞浸出液对 DPPH·、ABTS+·的清除能力较强，对羟基自由基的清除能力较弱，这与本试验中石榴果皮类黄酮清除几种自由基的能力相似。本试验发现，未经大孔树脂纯化的类黄酮粗提液也具有清除自由基能力。石榴果皮粗提液中含有生物碱、多酚等多种成分。粗提液对羟自由基、ABTS+·、DPPH·的清除能力高于纯化液，但对超氧自由基的清除能力低于纯化液。这可能是由于不同物质对各种自由基的效应不同。

本试验采用石榴果皮（包括外果皮、中果皮）提取类黄酮，最佳条件为超声10次（持续时间 5 s/次）、浸提温度65 ℃、乙醇体积分数35%、浸提时间4 h、料液比 1 g ∶ 60 mL，类黄酮提取量为21.34 mg/g。类黄酮纯化物清除羟自由基、超氧自由基、ABTS+·和DPPH·的IC50分别为1.22 mg/mL、0.061 mg/mL、0.16 mg/mL、1.37 μg/mL，与维生素C的IC50（0.87 mg/mL、0.094 mg/mL、0.07 mg/mL、2.88 μg/mL）接近。这为石榴果皮作为类黄酮提取原料、提高石榴果皮废物资源化利用提供了试验依据。