许建兰 马瑞娟 俞明亮 张妤艳 丁辉

摘要：以早红2号桃种胚为试材，研究不同赤霉素浓度和低温处理时间对桃种胚萌发和植株生长的影响，并比较莲座状苗与正常苗体内激素差异。结果表明，在同样的低温处理条件下，随着赤霉素浓度的提高，子叶开张比例不断增加。当培养基中加入1.0 mg/L及以上赤霉素浓度时，低温培养30 d和60 d畸形苗即可消失;当培养基中加入 0.5 mg/L 及以上赤霉素浓度时，低温培养90 d畸形苗即可消失，且发现同样条件下赤霉素浓度越高，畸形苗率越低。对种胚发芽后正常苗与莲座状苗进行比较，发现IAA含量正常苗高于莲座状苗，GA和ZA含量则相反。综上，在早红2号种胚处理时加入适量的赤霉素可减少莲座状苗的比例，进而提高胚培种子成苗率，对提高早熟桃种子育苗效率具有重要意义。

关键词：桃;低温时间;激素;赤霉素;种胚;植株生长

中图分类号： S662.101  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）23-0121-03

目前桃新品种选育主要通过常规杂交授粉进行，通常果实生育期100 d以内的桃，生长时间短，种子在常规处理条件下不能萌发或萌发率极低，即使长成实生苗，早期生长也比较弱小[1-2]。因此需接种在培养基中，经过适当的培养后才能萌发成苗。种子休眠是高等植物的普遍现象，在生产上，桃种子需要经过一段时间低温处理才能正常生长，若休眠未能及时解除，往往出现发芽率低甚至隔年发芽的现象[3]，有些即使发芽生长仍会出现不良状况，严重影响正常育苗工作。缩短低温处理时间、增加温室过渡生长时间是一种提高实生苗壮实度的有效方法。但不经过足够低温处理的胚发芽后叶片会长成莲座状，不能正常生长，严重的最终导致死亡。

有研究表明，赤霉素（GA3）是一种生长调节剂，在休眠方面已有大量报道[4-7]，但多集中于晚熟桃种子处理，而关于早熟胚打破休眠方面报道较少。刘艳萍[8]和孙红梅[9]先后研究了低温解除休眠的生理生化变化，表明休眠主要依靠GA3和ABA含量控制。高效液相色谱（HPLC）是常用的植物内源激素分析方法，但HPLC存在流程繁琐、费时长、不能同时联合测定等问题[10]。而液质联用（LS-MS）解决了HPLC的不足，在激素检测中达到了很好的效果。为此，笔者在总结前人研究的基础上，采用液质联用技术，样品一次处理，分时出峰，从而更方便快捷测定植株激素含量。

本试验通过探索不同赤霉素浓度对解除早熟桃种子休眠和促进实生苗生长的影响，并比较正常苗与莲座状苗在激素水平上的差异，为后期种子处理、实生苗健壮生长提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年进行，桃试验材料取自国家果树种质南京桃资源圃，品种为早红2号，果实生育期94 d。树体生长健壮，株行距3 m×5 m，自然开心形，按常规栽培措施管理。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 果实近成熟时采收，经70%乙醇和20%NaOCl溶液消毒，取出种仁接种到5种不同培养基中，对照，WPM;处理1～4为WPM培养基中分别添加不同浓度的GA3（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），蔗糖20 g/L，琼脂粉4.8 g/L，pH值5.7。每处理接种30个，3次重复。接种后分别置于4 ℃低温环境中处理30、60、90 d，比较不同低温处理时间对子叶张开比例、胚根生长的影响。后置于组培室（24 ℃）进行光照培养30 d，统计不同处理株高、叶片数、莲座状苗比例。

1.2.2 激素含量测定 分别取莲座状苗和正常苗新鲜植株，采用液质联用检测技术（LC-MS）测定IAA、GA3、ZA等激素的含量。样品制备时各称取约0.5 g，于液氮研磨至粉碎，加入5 mL异丙醇/盐酸提取缓冲液，4 ℃振荡30 min，加入10 mL二氯甲烷，4 ℃振荡30 min，于4 ℃、13 000 r/min离心 5 min，取下层有机相;避光以氮气吹干有机相，以200 μL甲醇（0.1%甲酸）溶解，过0.45 μm滤膜，进HPLC-MS/MS检测。每处理10个植株，重复3次。液相条件：色谱柱采用安捷伦ZORBAXSB-C18反相色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流动相A ∶ B=（甲醇/0.1%甲酸） ∶ （水/0.1%甲酸），洗脱梯度：0～2 min，A=20%;2～14 min，A递增至80%;14～15 min，A=80%;15.1 min，A递减至20%;15.1～20 min，A=20%，柱温30 ℃，进样体积2 μL;质谱条件：气帘气：15 psi;喷雾电压：4 500 V;雾化气压力：65 psi;辅助气压力：70 psi;雾化温度400 ℃。

1.3 数据分析

数据用Excel和SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同低温处理时间对种胚生长的影响

从表1可以看出，在同样的低温处理条件下，随着赤霉素浓度的提高，子叶开张比例不断增加。在低温处理30 d时，所有处理的子叶均未变化，保持闭合状态，随着低温处理时间的延长，子叶不同程度开展，表明種胚即将发芽生长。低温处理60 d时，以处理4子叶开张比例最高，为85.7%，与其他处理达显著差异;胚根最长，为0.8 cm，与对照和处理1、处理2达显著差异水平。低温处理90 d时，处理3和处理4子叶全部张开，胚根长度分别为 1.6 cm 和1.5 cm，处理3和处理4差异不显著，与其他处理达显著差异水平。

2.2 不同赤霉素浓度下低温处理30 d对试管苗生长的影响

从表2可以看出，低温处理30 d后，处理2平均株高最高，为7.25 cm，与其他处理达显著差异水平;平均叶片数以处理3最多，为10.27片，其次是处理4，为9.27片，处理3和处理4差异不显著，与对照、处理1、处理2达显著差异水平;以不加赤霉素的对照处理畸形苗率最高，为53.83%，与其他处理达显著差异水平，其次是处理1畸形苗率，为21.33%，可以发现，当培养基中加入1.0 mg/L及以上赤霉素，在低温培养30 d时畸形苗即可消失。

2.3 不同赤霉素浓度下低温处理60 d对试管苗生长的影响

从表3可以看出，低温处理60 d后，处理2平均株高最高，为7.38 cm，与其他处理达显著差异水平;平均叶片数以处理2最多，为11.25片，其次是处理3，为11.17片，处理2和处理3差异不显著，与对照、处理1、处理4达显著差异水平;以不加赤霉素的对照畸形苗率最高，为30%，与其他处理达显著差异水平，其次是处理1畸形苗率，为9.12%，可以发现，当培养基中加入1.0 mg/L及以上赤霉素，在低温培养60 d时无畸形苗。

2.4 不同赤霉素浓度下低温处理90 d对试管苗生长的影响

从表4可以看出， 低温处理90 d后， 处理4平均株高最高，为5.16 cm，其次为处理3，平均株高4.87 cm，处理3和处理4与其他处理达显著差异水平;平均叶片数以处理4最多，为11.60张，其次是处理3，为11.26张，与处理1、处理2差异显著;以不加赤霉素的对照畸形苗率最高，为11.13%，与其他处理达显著差异水平，比较发现，当培养基中加入0.5 mg/L及以上赤霉素，在低温培养90 d时无畸形苗。

2.5 正常苗与莲座状苗体内激素含量差异

通过对正常苗与莲座状苗的比较，看出正常生长的苗IAA含量显著高于莲座状苗，正常苗和莲座状苗IAA含量分别为5.98 ng/g和2.93 ng/g;而GA3和ZA含量以莲座状苗较高，正常苗和莲座状苗GA3含量分别为0.028 ng/g和0.116 ng/g，正常苗和莲座状苗ZA含量分别为0.05 ng/g和2.23 ng/g，且正常苗与莲座状苗间达显著差异水平（表5）。

3 讨论与结论

植物激素是指由植物细胞接受一定的信号诱导，在植物特定组织代谢合成的，并通过与特定的蛋白质受体结合来调节植物生长发育的微量生理活性有机物质[11]。植物激素的研究也一直是植物科学热点和前沿的领域之一，随着科技的发展，植物生长调节剂调控植物生长发育的重要作用越来越受人们重视。植物生长调节剂调节和控制作物生长发育的方法，既能协调植株的生长发育又能协调植株与外界条件的关系[12]。赤霉素除可以打破种子休眠外，在促进植株生长方面也具有一定作用[13]。

桃种子需要经过一定的低温层积才能正常发芽生长，低温层积所需时间也因品种不同而存在差异[3]，而同一品种随着层积时间的延长，莲座状苗比例明显降低。本试验中早红2号加入0.5 mg/L赤霉素低温处理30、60、90 d，莲座状苗比例分别为21.35%、9.11%和0，与前人报道的随层积时间越长，非正常苗比例越少的结论[14]一致。对照中不加赤霉素在低温培养90 d时仍有一定比例的莲座状苗，而加入赤霉素的处理，当浓度达到0.5 mg/L低温培养90 d时均无畸形苗，说明培养基中加入赤霉素一定程度上刺激了种子发芽，有助于提高正常苗的比例。比较发现，不同处理中加入赤霉素苗的高度均高于对照，与前人报道的赤霉素可以促进茎的伸长结果[12]一致。将正常苗与莲座状苗比较，发现正常苗IAA含量高于莲座状苗，可能是由于正常苗生长健壮，更有利于分泌生长素类物质，进而促进实生苗的生长。

本试验中早熟桃种子处理时加入一定量的赤霉素，有效减少了早红2号莲座状苗的比例，进而提高胚培种子成苗率，研究结果可为解除早熟桃种子休眠提供参考，对提高早熟桃种子育苗效率具有重要意义。

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