刘 波，刘 颖，王 涤，邢学良

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150000；2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD）是指新生儿在围产期或出生后因缺氧缺血而引起中枢神经受损的脑部疾病。近年来，已有证据证实细胞凋亡在缺氧缺血性脑损伤过程中发挥重要作用[1-2]。针康法是将头穴丛刺与现代康复技术结合起来的治疗方法，其对缺氧缺血性脑损伤患儿的运动、感觉、认知功能的提高及神经损伤的修复都发挥了重要作用[3]。动物实验表明，针康法可以通过调节控细胞凋亡相关因子及细胞凋亡通路等方式来降低缺血缺氧发生后脑神经的损伤程度，发挥保护神经元的作用[4]。细胞凋亡诱导因子（AIF）及死亡基因受体（Fas）作为细胞凋亡相关因子，在缺氧缺血损伤发生后发挥促凋亡作用，阻碍神经元的修复与再生[5]。本实验就缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮质中的AIFmRNA、FasmRNA 及细胞凋亡情况进行研究，同时运用针康法对大鼠进行治疗，探讨针康法治疗缺氧缺血性脑损伤的作用机制。

1 实验材料

出生7 日龄Wistar 大鼠幼仔160 只，由辽宁长生生物科技有限公司提供，许可证编号：SYXK（辽）2010-0001，雌雄不限，体质量均在11～15 g。8%O2+92%N2混合气体（哈尔滨鼎新工业气体有限公司）；针灸针（0.25 mm×25 mm，北京中研太和医疗器械有限公司）；转棒疲劳仪（上海欣软）；超速冷冻离心机（湖南湘仪）；PCR 仪（杭州BIOER）；电泳仪（北京六一）；真空干燥箱（上海SYSBERTY）；凝胶成像分析仪（北京六一）；CX41 型生物显微镜（日本OLYMPUS）。Tunel 凋亡试剂盒（武汉博士德公司）；总RNA 提取试剂盒（Trizol 法）；AIF、Fas 及GAPDH 引物合成（上海生工生物工程有限公司）；逆转录试剂盒（美国Invitrogen）。

2 实验方法

2.1 动物模型制备 建立HIBD 的Rice-Vannucci 模型和假手术模型[6]。将出生7 日龄Wistar 大鼠幼仔采用无水乙醚吸入麻醉方式进行麻醉（1.0～2.0 min），仰卧位固定，充分暴露颈部。局部碘伏消毒后，沿颈正中线剪开皮肤及皮下组织，分离出左侧颈总动脉，用0 号丝线行左侧颈总动脉双结扎后缝合颈部皮肤。术后将大鼠幼仔置于带有母鼠气味的窝中恢复2 h，然后再将大鼠幼仔放入37 ℃的有机玻璃缺氧箱中，持续充以气流量为1 L/min 的8%氧气，92%氮气混合气体2 h。建模后，将出现夹尾左旋的大鼠幼仔纳入实验。假手术组则只需要剪开大鼠颈部的皮肤并分离出左侧颈总动脉，不结扎，缝合皮肤后也不予缺氧处理，结束后放回母鼠笼中喂养。

2.2 分组及干预方法 将7 日龄Wistar 大鼠幼仔随机分为假手术组、模型组、针刺组、康复组与针康组5组，每组按建模后观察时间点的不同又分为12、24、48、72 h 这4 个亚组，每个亚组8 只大鼠幼仔。假手术组手术后回笼饲养，予以同等条件下的抓取。模型组造模后回笼饲养，予以同等条件下的抓取。针刺组造模后采用头穴丛刺针法对大鼠幼仔进行治疗。采用1.0寸针灸针，取百会穴及百会穴左、右侧各旁开1 mm处进行针刺，快速捻转1 min后留针2 h，每日针刺1次。康复组予大鼠幼仔以转笼、转棒等综合康复训练疗法。转笼为长100 cm，直径为60 cm 的金属圆柱形网笼，网笼分为4 格，可同时训练4 只大鼠幼仔。在进行转笼训练时可将转笼水平放置于金属架上，转动转笼一端的转动柄，按需要转动纵轴，每天训练10 min。转棒为一根长75 cm，直径为4.5 cm 的木棒，进行转棒训练时，将转棒两端悬挂，手动以5 r/min 的速度顺、逆时针交替转动木棒，每天训练10 min。针康组在造模后采用针康法进行治疗。在大鼠幼仔头穴丛刺针留针期间进行康复训练，1 次/d（针刺方案同针刺组，康复训练方案同康复组）。

2.3 采用RT-PCR 法检测大脑皮质中AIFmRNA 及FasmRNA 的表达水平 各组大鼠在治疗结束后按规定时间点断头取脑，之后将左侧大脑皮质快速剥离。取材结束后按照总RNA 试剂盒说明书，运用Trizol法提取总mRNA，并进行电泳以检测RNA 的完整性，之后在逆转录反应这一环节合成对应的cDNA，其操作方法也参照试剂盒说明书进行，最后，当聚合酶链反应结束时配制琼脂糖凝胶进行电泳，运用凝胶成像系统对得到的凝胶进行拍照并分析数据。各引物序列见表1。

表1 AIF、Fas、GAPDH 引物序列

2.4 原位末端标记法（TUNEL 法）检测大脑皮质中细胞凋亡变化 在规定时间点，大鼠乙醚麻醉后开胸，暴露心脏，剪开右心耳后将提前准备好的带有20 mL生理盐水的注射器插入至左心尖以冲洗血流，随后灌入20 mL 的4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PA）溶液，待灌注结束，迅速断头取脑剥离大脑皮质并置于4%PA溶液中充分固定。48 h 后行脱水、浸蜡、石蜡包埋，将样本制成5 μm 切片，之后进行TUNEL 染色，具体操作参照说明书。凋亡细胞，即阳性细胞在光镜下呈棕黄色或棕褐色，非凋亡细胞，即阴性细胞呈蓝色。在高倍镜（10×40）下每只大鼠随机选取5 张皮质切片以观察细胞凋亡的数量，后取均值作为统计参数。

2.5 统计学方法 所有数据均通过SPSS 19.0 软件进行分析，各数据均以均数±标准差（）的形式表示，多组间比较选用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用TukeyHSD 法，计量资料分析应用Pearson相关系数。

3 结果

3.1 不同时间点各组新生大鼠脑皮质中AIFmRNA与FasmRNA 的表达变化 见表2、表3。随着缺氧缺血损伤时间的延长，假手术组在各时间点的AIF、FasmRNA 表达均不明显，其余各组的AIF、FasmRNA在12 h 开始逐渐上升，并在24 h 时达到高峰，之后在48 h 和72 h 逐渐下降。与假手术组相比较，其余各组的AIF、FasmRNA 在各时间x 点的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组、康复组与针康组在各时间点的AIF、FasmRNA 表达差异有统计学意义（P＜0.05）；针康组与针刺组、康复组比较，其在各时间点的表达,差异也具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 不同时间点各组AIFmRNA 与GAPDHmRNA 的比值比较（，n=8）

表2 不同时间点各组AIFmRNA 与GAPDHmRNA 的比值比较（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与针刺组比较，▲P ＜0.05；与康复组比较，□P ＜0.05

3.2 不同时间点各组新生大鼠脑皮质细胞凋亡情况 因大脑皮质为细胞凋亡的易发区且对缺氧缺血损伤较为敏感，故本实验选取皮质进行细胞凋亡检测。如表4 所示，除假手术组，其余各组的细胞凋亡数均在12 h 逐渐上升，并在24 h 时到达高峰，之后在各时间点逐渐下降。与假手术组相比，其余各组在各时间点内的细胞凋亡数均具有显著差异（P＜0.05）；后3组在各时间点与模型组相比，其细胞凋亡数明显减少，有统计学意义（P＜0.05）；针康组的细胞凋亡数与针刺组及康复组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 不同时间点各组FasmRNA 与GAPDHmRNA 的比值比较（，n=8）

表3 不同时间点各组FasmRNA 与GAPDHmRNA 的比值比较（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与针刺组比较，▲P ＜0.05；与康复组比较，□P ＜0.05

表4 不同时间点各组凋亡阳性细胞数的比较（个/400 倍）（，n=8）

表4 不同时间点各组凋亡阳性细胞数的比较（个/400 倍）（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与针刺组比较，▲P ＜0.05；与康复组比较，□P ＜0.05

3 讨论

针康法是传统针灸技术与现代康复技术的结合，具有同步性、动态性、整体性等特点。针康法治疗内容的核心是，通过针刺刺激大脑皮层不同的反射区，加快大脑微循环的建立，并结合相应的运动功能训练、感觉功能训练等现代康复治疗方法，二者共同发挥效用，以非侵入的形式刺激中枢神经系统，从而达到促进大脑受损区域神经组织修复的目的[7]。并有研究表明，针康法可以通过促进神经轴突的重塑、维持细胞的存活、减少细胞凋亡、调控神经营养因子的浓度，降低脑损伤后出现的炎症反应，进而促进缺氧缺血脑组织神经功能的修复与再生[8]。

本次实验结果显示，针康法可以通过调节缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮质内AIF 与Fas 的表达来发挥抑制细胞凋亡作用。AIF 是一种线粒体黄素蛋白，具有调节细胞凋亡和维持线粒体功能的作用[9-10]。当细胞发生凋亡时，AIF 通过非Caspase 依赖性凋亡方式从线粒体中释放并转移至细胞核内，在细胞核中AIF 促进DNA 降解成20 至50-kb 并因此诱导细胞解体所需的染色质凝聚[11-12]。YANG C X 等[13]研究证实，AIF表达下调时可以增加脑缺氧缺血损伤后新生儿脑内细胞的存活率，减少细胞凋亡的发生。并且关于本实验中AIFmRNA 在各时间点的表达趋势和AIFmRNA 在各时间点的动态变化与缺氧缺血性脑损伤后脑内细胞凋亡变化规律吻合这两个发现，都与徐艳等[14]研究参附注射液对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠AIF 表达变化的结果一致。提示针康法可以通过抑制AIFmRNA 的表达减少细胞凋亡的发生，发挥脑保护作用。另外，细胞凋亡不仅与AIF 有关，更与细胞表面的死亡受体Fas 有关。Fas 作为细胞表面具有转膜作用的蛋白，属于肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor,TNF）受体家族。当Fas 的胞外域与其结合配体FasL 结合时可引发细胞凋亡。Fas-FasL 结合可诱导Fas 的局部结构发生变化，从而使Fas 的细胞内死亡域（FasDD）和Fas 相关死亡域（FADD）相互作用，最终激活细胞内源性和外源性两种凋亡途径以实现细胞凋亡[15]。马飞等[16]已证实，当脑组织发生缺血损伤时可促进Fas 表达上调，而当下调Fas 表达水平时可抑制脑缺血损伤后神经元的凋亡。这说明脑缺氧缺血性损伤可诱导Fas 参与细胞凋亡的调节过程。此外，有关本实验中FasmRNA 在24 h时达到表达高峰，后逐渐下降的这一表达趋势与各时间点细胞凋亡趋势一致的结果，与秦彦强等[17]研究针刺预处理对急性MACO 大鼠细胞凋亡影响的有关结果吻合。说明针康法可以通过调控FasmRNA 的表达来避免凋亡的发生，更好的保护脑组织。

细胞凋亡是一种高度调节和能量依赖的程序性细胞死亡（Programmedcelldeath,PCD），对早期胚胎发育和组织稳定至关重要[18-19]。细胞在受损后是否发生凋亡，是由促凋亡因子与抗凋亡因子二者谁能更好的发挥主导作用所决定的，在该过程中如果实施有效的干预抑制促凋亡因子，则可最大程度的保护脑组织，减少损伤[20-21]。本实验结果显示，各时间点针康组细胞凋亡数较模型组、针灸组及康复组显著减少（P＜0.05），说明针康法可有效减少缺氧缺血性脑损伤新生大鼠细胞凋亡数。

综上所述，通过本实验可进一步阐明针康法抑制缺氧缺血性脑损伤新生大鼠细胞凋亡的机制。针康法不仅能下调AIFmRNA 的表达水平，而且还能下调FasmRNA 的表达水平，从而减少细胞凋亡的发生，促进受损神经细胞的修复与再生。