张红岩，成光宇，初洪波，林艳玲，崔 畅

（1.吉林省中医药科学院，长春 130012；2.长春中医药大学，长春 130117）

五味枣仁颗粒是由酸枣仁、刺五加、五味子、茯苓等原料经提取、浓缩、干燥、混合、制粒等工艺制成的保健食品，经动物实验证明具有辅助改善睡眠功能。为了更好的控制产品质量，我们对产品质量标准进行了研究，采用薄层色谱法，对产品中各个原料进行薄层色谱鉴别，得出结论，五味子的色谱特征明显，阴性无干扰，重复性优，列入标准正文；此外，采用高效液相色谱法，对五味枣仁颗粒中酸枣仁所含斯皮诺素进行含量测定研究，建立了测定方法，对方法学进行了考察。通过以上研究，建立了五味枣仁颗粒质量控制方法，为更好保证产品质量奠定了基础。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪（日本岛津LC-10ATvp）、色谱工作站（日本LCsolution Lite）、电子分析天平（十万分之一）（瑞士，梅特勒-托利多XS105 型）、紫外可见分光光度计（上海恒平科学仪器有限公司UV-2800 型）、超声清洗仪（上海 生析超声仪）、斯皮诺素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111869－201203，含量计95.4%）、五味子醇甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110857－201714，含量计99.9%）、五味枣仁颗粒（北京海德润医药集团有限公司，批号：190401、190402、190403）、乙腈。

2 方法与结果

2.1 五味子薄层色谱鉴别 取五味子10 g，细磨，放入60 mL甲醇，置超声波处理30 min。滤后，将滤液蒸干，残渣加水10 mL使之尽量溶解。应用三氯甲烷提取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷的提取液，蒸干，残渣追加甲醇1 mL 溶解，当作供试品溶液。拿取五味子醇甲对照品，将其应用甲醇制作成1 mL/1 mg 的溶液当作对照品溶液。（中国药典2015年版四部 通则0502实验。拿取供试品溶液10 μL，和对照品溶液2 μL，两者点置相同一个硅胶GF254薄层板。依据石油醚（30 ℃～60 ℃）—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1）上层溶液当作展开剂，展开，并置晾干燥。搁置紫外灯（254 nm）检视。对照品色谱匹配对应的位置上跟供试品显着同种颜色斑点，见图1。

图1 五味子薄层色谱鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱条件为Hichrom C18（4.6×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈—水（16:84）；检测波长为335 nm。理论板数凭借斯皮诺素峰推出，不得不够2 000。

2.2.2 制作对照品溶液 拿取足够量的斯皮诺素对照品，称量精密，放入甲醇制l mL/40 μg 的溶液，可得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下本品适当量，研细，取2 g，准确称量置于具塞锥形瓶中，准确加入70%，25 mL 乙醇。量重后开展超声波处理（功率为250 w，频率40 kHz）30 min，取出，置冷并重次量定重量。以70%乙醇补予减少的重量，摇匀过滤且汇集续滤液，既得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 核查线性范围 精准足量称量斯皮诺素对照品，混合甲醇制浓度为0.1441 mg/mL 溶液。精准依序吸量0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL，分置10 mL 量瓶中，取来甲醇稀释至各量瓶刻度后且摇匀。分别另取量上述对照品溶液各10 μL，凭据方法测定。设立横坐标斯皮诺素的量，纵坐标设立峰面积，描画标准曲线。结果表明，在0.072～1.296 5 μg 之间范畴，斯皮诺素量，峰面积积分值互相存留优良线性关系。回归方程：Y=2 263 672.93 X+6 620.25，相关系数r=0.999 9。

2.2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，在不同时间点进样10 μL，测定峰面积积分值，选择时间点分别为0、2、4、8、12、24、36、48 h。结果，不同时间点测得得峰面积积分值分别为：1 071 800、1 079 037、1 075 475、1 073 717、1 075 998、1 079 360、1 080 823、1 095 603，RSD%=0.68；结果显明，样品中的斯皮诺素2 天内情况基本平稳。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取10 μL 3.2.3 项下供试品溶液，凭据已筛选的色谱条件，连续针对同一供试品溶液进样6 次，检测峰面积的积分值，结果，样品中斯皮诺素峰面积积分值分别为：1 047 563、1 053 695、1 059 511、1 059 364、1 057 924、1 056 048，RSD%=0.43。测定结果展现，本法设备精密度优良。

2.2.4.4 重复性试验 针对此批次的五味枣仁颗粒样品依据3.2.3 项下方法制成供试品溶液，共计6 份，凭据方法测定后测定的6 次结果依次是：0.575 3、0.579 3、0.567 5、0.578 5、0.582 1、0.583 8 mg/g，平均值为0.577 8 mg/g，RSD%=1.01。测定最终结果表明此方法重复性优。

2.2.4.5 加样回收率实验 取含量已知晓的五味枣仁颗粒6 份样品（批号为190401,斯皮诺素的含量57.45 mg/100 g），分别加入一定量斯皮诺素对照品，依法测定后计算出回收率。结论可得：关于斯皮诺素的均回收率为98.31%，RSD%=1.2，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.2.4.6 样品的测定 凭据方法测定三批试样品五味枣仁颗粒中的斯皮诺素含量，结果见表2。

表2 三批五味枣仁颗粒中斯皮诺素含量测定结果

3 讨论

3.1 薄层色谱法 五味子来源五味子科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，大部分出现于辽宁省、吉林省、黑龙江及内蒙古等地方，别称北五味子。其始载于《神农本草经》，性温，味酸、甘，归肺、心、肾经，主要功效为益气滋肾、生津敛汗、涩精止泻、宁心安神[1]。五味子包括多种成分，关键含有木脂素、挥发油、多糖、有机酸、三萜、氨基酸及无机元素等等。其中重要成分为木脂素类物质。其含五味子素、五味子甲素、五味子酯甲、新五味子素、五味子酯乙、五味子醇乙等等成分，大抵占有8%。2015 版《中国药典》有实确规定，五味子药材中蕴含的五味子醇甲应多于0.40%[2-3]中国药典2015版一部五味子鉴别项下中采用药材经三氯甲烷提取后蒸干，加三氯甲烷溶解，作为供试品进行鉴别，许多文献方法也与药典相同,也有直接用甲醇或乙酸乙酯超声提取[4-11]进行鉴别的。在本试验中，由于本品是经过水煎煮提取的，故在供试品溶液制备方法选择上采用甲醇提取后蒸干，残渣加水溶解，用三氯甲烷萃取后蒸干，用甲醇溶解做成供试品溶液，进行鉴别，依据此法操作可除去大部分杂质，所制备的供试品溶液不粘稠，易于点样。择选展开剂过程中，除去用属于2015 版中国药典一部五味子鉴别项下的展开体系石油醚（30～60 ℃）—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1）以外，也相比照了石油醚（60～90 ℃）—乙酸乙酯—甲酸（15:4.5:0.5）和环己烷—甲酸—乙酸乙酯（5:0.05:3）的分离效果。结果药典所用展开剂系统的分离效果远远超越二者。多次实验表明，所应用的薄层鉴别方法，斑点分离更清楚,重复性优,阴性无干扰,专属性较强。

3.2 含量测定

3.2.1 专属性试验 在已经选定的色谱条件下，样品中斯皮诺素色谱峰前后并无杂峰干扰，显示基本基线已经分离，结果为图2。

图2 五味枣仁颗粒高效液相色谱图

3.2.2 系统适用性试验 在查阅了斯皮诺素含量测定文献[12-22]基础上，实验比较了如下几种色谱柱和流动相分离效果：色谱柱：1）HICHROM C18（4.6 mm·250 mm·5 μm）。2）Agilent Zorbax（250 mm·4.6 mm·5 μm）。3）Waters symmetry（4.6 mm·250 mm·5 μm）。流动相：1）乙腈—水（20:80）2）乙腈—水（18:82）3）乙腈-水（15:85）4）乙腈—水（16:84）5）乙腈（A）-水（B）进行梯度洗脱（0～10 min，88% B～81% B；10～16 min，81% B～80% B；16～22 min，80%B～0% B；22～30 min，0% B），结果表明，3 种色谱柱配合乙腈—水（16:84）流动相，均能使样品中斯皮诺素与其它组分达到很好分离（分离度＞1.5），其中最优的HICHROM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和乙腈—水（16:84）组合，分离效果最好，保留时间适宜，故作为本试验的色谱条件。

3.2.3 耐用性试验 拿取批号同一的样品五味枣仁颗粒，依照上述测定条件，考查在测定条件有细微的波动时对测定结果作用程度。实验首要考察由不同型号色谱柱及不等柱温以及互异流动相配比等因素变动的条件下样品五味枣仁颗粒中斯皮诺素含量的影响。

3.2.3.1 色谱柱 本实验采用HICHROM-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SYMMETRY-C18 的不同型号色谱柱进行测定，结果在样品中测得斯皮诺素的含量依次是：0.577 8、0.577 4、0.576 6 mg/g，斯皮诺素的含量于不同型号柱及同一批样品中并无显著变化。

3.2.3.2 柱温 顺次在20 ℃、30 ℃、40 ℃柱温的条件量测样品中斯皮诺素含量依次是：0.569 9、0.579 7、0.574 6 mg/g，结果：等批次样品不同柱温斯皮诺素含量无突出改变。

3.2.3.3 流动相 选择乙腈—水（15:85）、乙腈—水（16:84）、乙腈—水（17:83）三个比例的流动相进行观察，结果斯皮诺素含量分别是0.573 4、0.580 7、0.582 4 mg/g。斯皮诺素含量在等批次不同流动相配比下无突出改变。

4 结语

上述试验结果表明，在有轻微色谱条件改变时，斯皮诺素的含量在样品中没有明显改变，产品薄层色谱鉴别和含量测定方式完美可行，重复性优，此种方法拥具优好的耐用性。