杨建华，王晓鹏，杨 筱，张一辉

（1.南京中医药大学，南京 210023；2.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215009）

肛瘘是肛肠科常见疾病之一，手术是其唯一根治的办法，但术后创面大、愈合时间长成为影响肛瘘术后临床疗效的主要问题[1]。虽然目前临床上各种保留括约肌等微创手术层出不穷，但传统手术方法仍无可替代[2]。肛瘘术后创面的愈合疗效在一定程度上影响着患者的生活质量，由于肛瘘术后创面长期受粪便污染，部分患者的愈合时间常常超过4 周，相当于西医学定义的慢性创面[3]。对于慢性创面延迟愈合的机制研究，多数学者认为与创面受到反复病原微生物污染导致的持续炎症刺激有关，这些促炎细胞因子的过度表达，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）等，均不利于创面的愈合[4]。紫黄生肌膏为我科传统制剂，由我院省名老中医黄礼主任中医师所创，临床使用多年，发现其具有明显的促进肛瘘术后创面愈合的作用[5-6]。因此，我们通过建立大鼠人粪污染创面模型，观察紫黄生肌膏对于大鼠人粪污染创面愈合及炎症因子的影响，探讨紫黄生肌膏的促愈机制，并为临床使用提供一定的实验依据。

1 实验材料

雌性4～5 周SD 大鼠84 只，单笼饲养，温度：（23±4）℃，湿度：（55±5）%。紫黄生肌膏由南京中医药大学苏州附属医院药剂科制备，组方：紫草15 g，大黄10 g，白芷15 g，甘草30 g，当归身30 g，血竭12 g，珍珠粉6 g，白蜡60 g，麻油500 g。重组牛碱性成纤维细胞生长因子（商品名：贝复济）由珠海亿胜生物制药有限公司生产，规格为：63 000 IU/15 mL，国药准字S10980077，产品批号：01171101。粪液的制备：选取正常人的粪便10 g，加入到10 mL 生理盐水中，搅拌均匀后用离心机离心，取其上清液，每天现配现用。中性树（国药集团化学试剂有限公司，10004160）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，1330-20-7）；Rat-TNF-α（江苏凯基生物技术股份有限公司，KGERC102a）；Rat-IL-6（江苏凯基生物技术股份有限公司，KGERC003）；生物倒置显微镜（Olympus,BX41）；生物荧光显微镜（Olympus,BX43）；酶标仪（MD SpectraMax M3）。

2 实验方法

2.1 动物造模 参照付小兵[7]、郑雪平[8]的造模方法，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，备皮区用碘伏常规消毒，用直径为1.8 cm 的圆形印章分别在大鼠的脊柱两侧约2 cm 处做一标记，然后依据标记制作2 个圆形创面，深度约0.3 cm，基本达肌层，压迫止血后，将约1 mL 粪液涂在创面上，包扎固定。48 h 后去除覆盖物，观察创面见伤口有黄脓性分泌物，有粪臭味者为造模成功。

2.2 实验分组 将所有大鼠进行数字编号后按照随机数字表法分成4 组：正常组21 只、模型组21 只、贝复济组21 只和紫黄生肌膏组21 只。

2.3 给药方法 造模成功后，按照 组别及分组方案开始用药，各组每天换药前0.5 h 在创面涂抹粪液1 mL，保持0.5 h 后统一换药，均常规用呋喃西林消毒清洁创面。正常组：剪开创面，不涂粪液，外敷无菌纱布，换药1 次/d；模型组：每天涂抹粪液，外敷无菌纱布，换药1 次/d；贝复济组：每天涂抹粪液，用贝复济（60 U/cm2）浸润的纱布敷在创面上，换药1 次/d；紫黄生肌膏组：每天涂抹粪液，用紫黄生肌膏（0.2 g/cm2）浸润的纱布敷在创面上，换药1 次/d。

2.4 取材 用药后第3、7、14 d 分批次随机处死5只大鼠，取大鼠创面中心至创缘部分的肉芽组织，约0.5 cm×0.5 cm，常规石蜡切片处理。

3 结果

3.1 一般情况观察 84 只大鼠术后应用粪液造模，在48 h 后出现个别大鼠死亡现象，其中模型组死亡2 只，贝复济组和紫黄生肌膏组各死亡大鼠1 只。其余造模成功大鼠均正常进食和饮水，状态良好，背部创面见创缘组织水肿及少许渗液和脓苔覆盖。贝复济组和紫黄生肌膏组创面生长速度较快，肉芽组织色泽好转迅速，肉芽填充速度较模型组快，组织水肿亦较模型组好转快。用药后第3 d 除正常组大鼠创面肉芽新鲜，色泽红润，其余各组大鼠的感染创面色泽均晦暗，创面渗液较多，创缘少许炎性水肿，创面坏死组织较多，尤以模型组大鼠创面较为明显；用药后第7 d 见正常组愈合最快，模型组愈合最慢，贝复济组和紫黄生肌膏组的创面较模型组创面色泽稍好，渗液减少，创缘组织水肿好转；用药后第14 d 正常组大鼠创面较前明显缩小，紫黄生肌膏组和贝复济组的创面较模型组愈合快，创缘毛发生长亦较快，肉芽组织填充明显。

3.2 各组创面愈合率比较 见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率比较情况（） %

表1 各组大鼠创面愈合率比较情况（） %

注：与模型组比较，## P ＜0.01；与贝复济组比较，△△P ＜0.01

3.3 各组创面肉芽组织TNF-α 表达的变化 见表2。

表2 各组大鼠创面TNF-α 表达的变化（，n=5） pg/mL

表2 各组大鼠创面TNF-α 表达的变化（，n=5） pg/mL

注：与模型组比较，## P ＜0.01；与贝复济组比较，△△P ＜0.01

3.4 各组创面肉芽组织IL-6 表达的变化 见表3。

表3 各组大鼠创面IL-6 表达的变化（，n=5） pg/mL

表3 各组大鼠创面IL-6 表达的变化（，n=5） pg/mL

注：与模型组比较，## P ＜0.01；与贝复济组比较，△△P ＜0.01

4 讨论

伤口愈合是一个复杂的过程，涉及很多相互依赖和重叠的阶段，包括止血、炎症、增殖、血管化、基质生成和重塑等[9]。许多类型的细胞参与伤口愈合的每个阶段，包括免疫细胞、内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞，这些细胞在基因表达和表型上发生了显著变化[10]。但某些急性或慢性伤口可导致炎症加剧，破坏创面的连续反应，从而延迟创面的愈合过程，并造成疤痕[11]。然而，完全抑制炎症可能导致伤口愈合受损，因为炎症是刺激伤口愈合中增殖阶段所必需的[12]。因此，控制炎症对于更好的伤口愈合至关重要。

在伤口愈合过程中，TNF-α 和IL-6 是主要的再上皮化和炎症介质启动因子，直接或间接（通过诱导其他细胞因子和生长因子）影响成纤维细胞功能的修复作用[13]。虽然TNF-α 能刺激皮肤成纤维细胞增殖，但它能阻止内皮细胞增殖并导致内皮细胞凋亡。低水平的TNF-α 可以间接刺激炎症，增加巨噬细胞产生生长因子，从而增强伤口愈合[14]。持续性炎症和组织破坏则是由TNF-α 的过度产生引起的。众所周知，过度炎症是损伤创面愈合的重要原因之一，长期升高TNF-α可通过增加成纤维细胞凋亡和减少金属蛋白酶组织抑制剂、生长因子和胶原的表达而导致创面延迟愈合[15-16]。IL-6 同样是一种促炎和抗炎的细胞因子，主要来源是单核细胞、巨噬细胞和Th2 细胞等，在调节免疫反应、促进胶原沉积和血管生成中起重要作用[17]。IL-6 参与了伤口愈合的各个阶段，其过度激活或抑制均可影响创面的愈合进程[18]。在本实验中，第3 d 模型组大鼠人粪污染创面TNF-α 和IL-6 的表达量明显高于正常组（P＜0.01），说明大鼠创面在人粪污染后局部炎症反应明显加重，创面中的TNF-α 和IL-6 等促炎细胞因子明显升高，处于过度激活状态，从而会导致了创面的延迟愈合。通过第7 d 和第14 d 的创面愈合率情况，进一步验证了模型组创面的愈合进程较慢，明显低于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

紫黄生肌膏由我院省名老中医黄礼主任中医师根据生肌玉红膏化裁而来，生肌玉红膏出自《外科正宗》，乃历代疮家之圣药，临床治疗慢性创面疗效显著[19]。但近年来因传统制剂中多含有轻粉等有毒成分，临床使用受限，许多效果较好的名方验方渐淡出临床。为了继承和发扬祖国传统医学，在结合现代药理基础之上，黄礼主任中医师去除生肌玉红膏中的轻粉，加入了大黄和珍珠粉。研究表明，大黄外用具有抑菌抗炎、收敛生肌功效，能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌以及铜绿假单胞菌等的生长[20]。现代临床中大黄外治多用于慢性下肢溃疡、糖尿病足感染、慢性窦道等疾病，白明等[21]通过实验观察外用大黄对小鼠耳廓肿胀、大鼠足跖肿胀、创伤性皮肤溃疡以及痔疮模型的影响，发现不同品种的大黄均能够抑制小鼠的耳廓肿胀和大鼠的足跖肿胀，促进溃疡皮肤角质层、鳞状细胞层和局部病理组织的恢复，加快大鼠创伤性皮肤溃疡和肛周皮肤溃疡的愈合。珍珠粉外用具有清热解毒生肌之功效，研究证实，水溶性珍珠粉有促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用[22]。

紫黄生肌膏在我科临床使用多年，对于肛瘘术后、慢性下肢溃疡以及糖尿病足溃疡等均具有良好的临床疗效。本实验研究通过大鼠人粪污染创面建立肛瘘术后慢性感染创面模型，进一步证实紫黄生肌膏能够提高大鼠人粪污染创面的愈合率，加快创面的愈合速度，且可以下调创面TNF-a、IL-6 促炎细胞因子的表达，抑制创面炎症因子的释放，减轻创面的炎症反应，该作用可能是通过下调p38MAPK 信号通路来实现。