许雲 何媛

传统观点认为，细胞死亡有2种形式：细胞坏死和细胞凋亡。细胞死亡是生命的基本过程，对多细胞生物的发育、自稳平衡及发病机制起重要作用。随着对细胞死亡机制的不断深入研究，发现在某些情况下坏死也会受到一系列信号分子调控。Degterev等[1]开展研究并筛选15 000种化合物，找到一个小分子命名为necrostatin-1(Nec-1)，这种可被Nec-1特异性阻断的与死亡受体相关的坏死被称为程序性坏死，它是一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)非依赖性的细胞死亡方式。越来越多的研究发现程序性坏死在视网膜疾病发生和发展中起关键作用，如视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)[2]、视网膜脱离(retinal detachment,RD)[3]、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)[4]、视网膜缺血性疾病[5]和青光眼[6]等。本文就程序性坏死的分子机制及其在视网膜疾病中的作用进行综述，探究程序性坏死与视网膜疾病的关系，为治疗视网膜疾病提供新思路。

1 程序性坏死及分子机制

1.1 程序性坏死的定义程序性坏死又称坏死性凋亡，是近年来发现的一类在凋亡通路抑制条件下，配体与死亡受体结合可控性非caspase依赖的新型细胞死亡方式，RIP1和RIP3是其关键的调控因子。其是一种既受死亡信号调控，又有坏死样结构特点的死亡形式[7]。

1.2 细胞程序性坏死的启动程序性坏死的启动因子颇多[7-8]，死亡受体家族里包含死亡结构域的一类受体，包括肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、自杀相关因子(factor associated suicide,Fas)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor,TRAIL)和死亡受体3(death receptor 3,DR3)、DR4等及模式分子受体，此类受体包括存在于细胞膜和内含体膜表面相关的Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)和病原生物表面的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)等[7-8]，死亡受体与相应的死亡受体配体结合后，便可激活启动信号通路，不同的细胞根据其所处内外环境及活化程度选择凋亡或程序性坏死。

1.3 程序性坏死的信号转导目前研究最广泛的程序性坏死模式由TNFR1介导。TNF诱导的细胞死亡需要TNF在细胞膜上与TNFR1结合，并在细胞内募集多种蛋白参与这一级联反应过程形成不同的复合体。其中，由TNF受体相关死亡结构域(TNFR-associated death domain,TRADD)、TNFR相关因子2(TNFR-associated factor 2,TRAF2)、TRAF5、胞内凋亡蛋白抑制因1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1)、cIAP2、RIP1和线性泛素链组装复合物(linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC)等组成复合体Ⅰ[9-10]。RIP1的泛素化在调节其激酶活性中起着重要作用，RIPK1通过cIAP1和cIAP2泛素化，招募转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1,TAK1)、TAK 结合蛋白2(TAK1-binding protein 2,TAB2)、TAB3，形成TAK1-TAB2-TAB3复合物，从而激活核因子-κB信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)级联反应，形成促炎症信号并抑制细胞死亡。当RIP1上的K63多聚泛素链被去泛素化酶CYLD[11]或泛素修饰酶A20[12]切割后，TNFR1信号复合体Ⅰ变得不稳定，去泛素化RIP1从复合体Ⅰ解离，与TRADD、Fas死亡结构域相关蛋白(Fas-associated protein via death domain,FADD)及caspase-8形成复合体Ⅱa，启动细胞发生凋亡[13]。当cIAPs、TAK1的表达下降或敲除[14]及NEMO敲除[15]，TNF刺激促进由RIP1、RIP3、FADD和pro-caspase-8组成的复合体Ⅱb的形成，当caspase-8活性降低或RIPK3和MLKL水平较高时，复合物 Ⅱ b可能通过坏死体形成而起作用。当caspase-8被抑制或缺失时，RIP1和RIP3通过RHIM结合使RIP1发生磷酸化，同时在刺激因子作用下RIP3的Thr231和Ser232位点发生自磷酸化，活化的RIP1-RIP3复合体发生淀粉蛋白样结构改变，激活MLKL并启动下游坏死性凋亡信号，结合成necrosome复合物(由RIP1、RIP3和MLKL组成)[16]，启动程序性坏死的发生[17]。

1.4 程序性坏死的执行MLKL已被确定为程序性坏死通路中最下游的效应分子[18]。MLKL是拥有激酶结构域但无激酶功能的假激酶，包含N-端4个卷曲螺旋束结构域和C-端假性激酶样结构域，将二者相连的2个α-螺旋连接域是程序性坏死关键，它在两者之间传递磷酸化信号[19]。RIP3与MLKL的结合依赖于RIP3激酶的活性和RIP3磷酸化[20]，RIPK3介导MLKL激酶结构域Thr357和Ser358磷酸化导致MLKL构象改变，转化为开放的活性构象暴露4HBD，形成依赖于二硫键的类淀粉样聚合物[21-23]。随后形成的MLKL寡聚体从细胞质转移到细胞膜，并与膜上的心磷脂和脂类物质磷脂酰肌醇结合，磷酸肌醇作为一种新发现的调节程序性死亡的分子，在MLKL寡聚和质膜定位中起关键作用[22]，能破坏细胞膜完整性并形成孔道[24-26]，离子和细胞因子从破裂的质膜中释放出来，以及Na+、Ca2+的内流，最终诱发程序性坏死[27-30]。最近研究发现，热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)能调控TNF诱导的程序性坏死，Hsp90与其协同伴侣分子(CDC37)对程序性坏死关键蛋白(RIP1、RIP3或MLKL)的激活和稳定是必不可少的[31]，Hsp90促进MLKL寡聚及向细胞膜转移，促进MLKL引起的细胞程序性坏死[32-33]。Hsp90的抑制剂如格尔德霉素(geldanamycin,GA)和kongensin A(KA)，可通过靶向Hsp90的不同位点来保护细胞免于程序性坏死[33-35]。

2 程序性坏死与视网膜疾病的关系

2.1 程序性坏死与RPRP是一个可致盲的遗传性视网膜疾病家族。在RP中，光感受器细胞死亡是视力下降的基础，视力丧失通常始于视杆细胞功能障碍和死亡而导致的夜视力丧失，随后继发视锥细胞死亡而导致的中心视力丧失。基因分析已确定超过40多种基因突变与RP相关，而这些突变基因大多在视杆细胞中唯一表达，不存在基因突变的视锥细胞在视杆细胞丢失后死亡。Murakami等[2]以视杆细胞特异性基因Pde6β突变模拟RP小鼠模型，发现视杆细胞具有凋亡形态，未见RIP的表达，而视锥细胞呈坏死的形态，且RIP1和RIP3表达水平均升高，RIP3缺乏可降低视锥细胞死亡和小胶质细胞活化，RIP激酶介导程序性坏死机制是RP小鼠视锥细胞死亡的主要形式。在pde6c(-/-)斑马鱼模型中，视锥细胞表达高水平的RIP1和RIP3，相反，视杆细胞依赖caspase凋亡途径，在敲除IRP3的pde6c(-/-)斑马鱼模型中也得出相同的结论[36]。上述研究证明程序性坏死很可能是RP中视锥细胞死亡的主要机制。Sato等[37]建立光感受器间维生素A类结合蛋白缺陷RP小鼠模型，他们在其模型中观察到RIP1和RIP3表达增加，抑制RIP1激酶能防止视锥细胞发生程序性坏死。这提供了进一步的证据表明，至少在某些疾病模型中，抑制RIP通路可能是治疗RP的靶点。在突变型视紫红质s334ter小鼠模型中，视杆细胞变性最初是依赖caspase凋亡介导，而视锥细胞的死亡则是通过程序性坏死作用。然而，在突变型视紫红质sp23h小鼠模型中，视杆细胞通过RIP3依赖程序性坏死而死亡，而视锥细胞则因炎症体的激活而死亡[38]。表明在RP不同模型中视锥细胞和视杆细胞具有不同的死亡机制。研究发现rd10/SIR(+/+)与rd10/SIR(+/+)小鼠相比，视网膜RIP1和RIP 3在5周后显著升高，SIR基因敲除促进视网膜RIP1/RIP3通路的激活，也可促进caspase-3的激活，表明SIR基因敲除对rd 10小鼠光感受器细胞的双相作用，起初促进视杆细胞的存活，然后加剧视杆细胞凋亡，最后是继发视锥细胞程序性坏死[39]。

2.2 程序性坏死与RDRD是视网膜神经上皮层和色素上皮层分离，RD后存在死亡受体通路的激活，光感受器细胞不仅有凋亡，同时还可能发生程序性坏死[40]。Dong等[3]在视网膜退行性病变小鼠用caspase抑制剂进行诱导后，可有效降低光感受器细胞凋亡率，但并不能阻止光感受器细胞继续丢失，其坏死率增加，且Nec-1通过抑制RIP1磷酸化阻止光感受器细胞死亡。他们继续在Sprague-Dawley大鼠视网膜下注入10 g·L-1透明质酸钠建立RD模型，电子显微镜观察光感受器细胞的死亡方式及形态学特点，光感受器细胞的死亡方式主要为凋亡和坏死及光感受器细胞形态与坏死细胞类似，表现为细胞肿胀，质膜不完整、破裂，染色质浓集和边聚，且伴有明显的自噬泡[41]。其研究还发现，RD 3 d后，光感受器细胞程序性坏死是由RIP1磷酸化激活介导的，与LC-3Ⅱ和自噬体的诱导有关，Nec-1也可以抑制RIP1磷酸化和LC-3Ⅱ诱导[42]。这些研究表明在RD病程中，程序性坏死也是光感受器细胞死亡的另一条主要途径。最新研究表明，在Sprague-Dawley大鼠视网膜下注射透明质酸钠建立RD动物模型，并在视网膜下注射Z-VAD-FMK或Z-VAD-FMK与雷帕霉素组合，caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以抑制细胞凋亡，但增加RIP介导程序性坏死，而雷帕霉素联合Z-VAD-FMK可以减少光感受器细胞坏死，通过抑制RIP-1表达来阻止Z-VAD-FMK诱导的程序性坏死[43]。给Sprague-Dawley大鼠注射CYLDsh RNA慢病毒(抑制CYLD的表达)3周后，进行视网膜脱离手术，发现CYLD表达下调导致caspase-8活性降低，感光细胞凋亡的数目减少，泛素化RIP1水平升高，CYLD通过调节泛素化RIP1来调节光感受器细胞的凋亡和程序性坏死[44]。 Daruich等[45]在铁超负荷培养条件下建立了大鼠RD体外模型，研究铁转运蛋白对视网膜的保护作用。研究表明，铁转运蛋白通过减少细胞凋亡、炎症和氧化应激而发挥视网膜神经保护作用[46]。最近研究发现，铁转运蛋白能降低RD诱导的细胞凋亡和程序性坏死[45]。补充铁转运蛋白作为手术的辅助治疗，改善RD患者的视力可能是治疗RD一种新的治疗策略。

2.3 程序性坏死与AMDAMD是一种缓慢进展的疾病，其特征是视网膜光感受器和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞变性及脉络膜新生血管的形成。AMD被认为是一种病因不明的多因素疾病，遗传因素、氧化应激和炎症等是AMD发病的重要因素。以往的研究大多认为凋亡是RPE细胞在氧化应激诱导后死亡的主要机制，目前研究发现，在氧化应激作用下，RPE细胞出现ATP耗竭、RIPK3聚集，高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein 1,HMGB1)从细胞核中释放，核膜和质膜渗漏及破坏，这是RPE细胞发生程序性坏死的主要特征，用siRNA敲除RIPK3能提高氧化应激引起RPE细胞存活率。在AMD小鼠和AMD(特别是GA)患者中也能观察到细胞肿胀和空泡化等坏死特征，说明程序性坏死是RPE细胞在氧化应激下死亡的主要途径[4,47]。NaIO3可致RPE细胞急性氧化损伤，RPE细胞发生坏死，随后出现光感受器细胞凋亡和视网膜变薄，NaNO3诱导RPE细胞程序性坏死和光感受器细胞凋亡，Nec-1能显著降低NaNO3诱导的RPE细胞死亡，但对光感受器细胞无保护作用[48-49]。在dsRNA诱导的视网膜退化小鼠模型中，dsRNA是AMD中玻璃膜疣的组分，dsRNA等促炎成分参与了RPE细胞程序性坏死，在视网膜下腔注射聚肌苷酸胞苷酸，RPE细胞更多地表现出程序性坏死的特征，视网膜组织RIP3水平升高，RIPK3敲除小鼠中同样注射聚肌苷酸胞苷酸，RPE细胞程序性坏死比率下降[50]。在Ccl2(-/-)/CX3cr1(-/-)小鼠、高胆固醇饮食载脂蛋白E敲除AMD小鼠模型，出现RPE细胞肿胀和空泡化，这是坏死的典型特征[4]。这些研究充分证明在AMD发展过程中，程序性坏死对RPE细胞死亡起重要作用。在TNF诱导的细胞凋亡过程中，caspase-8通过切割RIPK3抑制RIP3-RIP1激酶复合物依赖的程序性坏死，因RPE细胞中caspase-8和DFF蛋白的表达水平较低[51]，当RPE细胞的凋亡通路受到损害，RPE细胞更容易走向程序性坏死，这与RPE细胞主要死于程序性坏死的假设是一致的。苯二酚衍生物4-AC抑制RIP3激酶激活和减少HMGB1释放及上调NQO1和HO-1基因，减少细胞内ROS，从而保护RPE细胞免受氧化应激所致的坏死[52]。Xiao等[53]发现NaIO3氧化RPE细胞，fas激活分别导致RPE细胞和光感受器细胞的程序性坏死和凋亡及视网膜外的小胶质细胞/巨噬细胞数量显著增加，然而，Fas受体的小肽拮抗剂MET12，显著降低fas介导的死亡通路的激活，具有保护RPE细胞和光感受器细胞免受氧化应激所致的程序性坏死和凋亡。综上所述，基础实验均证实了在AMD病程中，RPE的死亡与程序性坏死有关，阻断程序性坏死途径也可能是治疗AMD一种新方法。

2.4 程序性坏死与缺血性视网膜疾病视网膜缺血再灌注(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)损伤参与了许多视网膜疾病的病理过程，RIRI是常见的致盲原因。程序性坏死在RIRI中的关键作用已被证明[5]。Kim等[54]发现RIRI TNF-α表达增加，尤其在神经节细胞层中，TNF-α激活引起程序性坏死因子的释放，Nec-1可降低视网膜RIP1水平，减少视网膜细胞丢失。彭亚力等[55]在RIRI小鼠使用Nec-1后，RIP1和RIP3的mRNA表达均显著降低，视网膜中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的mRNA表达降低，然而Nec-1对caspase-8 mRNA表达无影响。结合程序性坏死有大量炎症发生的特点，使用Nec-1后促炎因子的表达降低，也从另一个方面印证了其对程序性坏死的阻断作用。Dvoriantchikova等[56]发现Nec-1抑制视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)RIPK 1/RIPK 3通路的激活，可显著减轻缺血再灌注引起的RGC程序性坏死和促炎因子的表达，从而表明RGC程序性死亡在缺血再灌注后通过细胞直接丢失和诱导炎症反应导致视网膜损伤。Gao等[6]报道RIRI早期，RGC通过ERK 1/2-RIP 3通路参与了程序性坏死，ERK直接或间接地促进RIP3的积累，诱导坏死小体的聚集，激活下游信号，导致程序性坏死。

2.5 程序性坏死与青光眼青光眼是一组以RGC死亡和形成视神经纤维的轴突变性为特征的疾病。青光眼病程中RGCs在不同时间死亡的原因涉及许多潜在因素，包括缺血、静水压、蓝光和视网膜胶质细胞释放的多种化学物质等[57-61]，缺血性损伤导致视网膜细胞凋亡和程序性坏死[62]，眼压的快速升高是引起急性青光眼的一个重要易感因素。Rosenbaum等[5]在大鼠急性高眼压模型，发现大鼠视网膜神经节细胞层存在大量坏死细胞，RIP3的上调参与RGC程序性坏死[63]。高眼压对穿行于视盘的视网膜中央动脉压迫引起RGC缺氧-缺血外一个重要的病理生理机制[64]，氧-糖剥夺处理后RGC-5存在程序性坏死，且RIP3通过氧化应激介导了RGC-5的程序性坏死[65]。Del等[66]发现蓝光导致RGC活力丧失，同时增加RIP1和RIP3表达，Nec-1对光诱导RGC的死亡有显著的抑制作用，而caspase抑制剂Z-VAD-FMK未显示出这种作用。最近研究表明，RIC一种新型的RIPK1抑制性化合物，RIC在体内和体外均抑制RIPK1催化活性，阻断RGC程序性坏死是通过阻断坏死小体形成和线粒体功能障碍，RIC对急性高眼压所致大鼠青光眼模型中导致RGC损失有保护作用[67]。

3 小结

在许多致盲的视网膜疾病中，视网膜细胞死亡是视力丧失的根本原因。这不仅包括各种遗传性视网膜营养不良，如RP，而且更常见眼底疾病，如AMD、RD、青光眼等。不同视网膜疾病死亡机制也有差异，随着对视网膜细胞死亡的更多研究，发现程序性坏死在多种视网膜疾病的发生和发展中扮演了重要角色，并且明确了程序性坏死在不同视网膜疾病中的作用机制及应用。针对程序性坏死进行调控也成为治疗这些疾病的有希望的发展方向。