钱 坤，李春青

（天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心 300402）

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒所引发的一类高度接触传染性、急性、病毒性呼吸道病变。 该疾病于全球范围内广泛分布，是一类严重威胁全球养殖业的重大传染疾病。

病禽的主要特征为气管啰音、打喷嚏、咳嗽等等[1]。 在发病之后，会侵害病禽的泌尿生殖系统、呼吸系统、消化系统等等。 该疾病的死亡率较高，会引起小鸡死亡。 成年产蛋鸡群感染之后，会导致产蛋量降低，体质下降，另外还会导致受到感染的幼鸡群增重以及饲料报酬显著下降。 特此，本文全面分析鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR 检测方式的有效性，现将具体结果报告如下。

1 病原

IBV 归属于冠状病毒科， 致病性较为复杂， 有着多种血清型。 在中国，鸡传染性气管炎具体的流行株为Gray 株、Hotle 株、Mass 株以及T 株。另外也存在大量的变异菌株。临床诊断可将其分为肠型、肾型、腺胃型以及呼吸型等几类。 值得说明的是，单纯凭借临床解剖通常无法获得详细病因， 所以说有必要取得实验室检测结果。 和以往相比，当前我国分子生物学技术有所进展。在这种情况之下， 国内诸多学者依然将RT-PCR 技术应用于IBV 病毒检测之中。

IBV 属于不分节段单股正链RNA 病毒。 其中因mRNA4 编码病毒膜蛋白为一类跨膜蛋白。 其属于IBV 粒子内含量最高的糖蛋白类别。于IBV 装配成熟整体过程中，起到了不可代替的作用。

2 IBV 病毒RT-PCR 检测具体方法

2.1 IBV 病毒RNA 提取步骤

第一，IBV 病毒RNA 提取；第二，IBV 病毒DNA 提取。

2.2 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应相关步骤

第一，RT 利用20μL 体系予以完成；第二，M 基因扩增利用50μl 体系予以完成。

在此之后实施特异性鉴定以及敏感性鉴定。

特异性鉴定利用所创建的PCR 方法有效扩增相关病毒测定该类方法的特异性。 回收IBV RT-PCR 电泳条带， 并和pMD18-T 载体相连，处理转化感受态DH5α。 铺氨苄抗性LB 琼脂平板，在37℃环境之下倒置培养处理，经过鉴定之后择取阳性菌落，实施扩大培养后进行测序。

敏感性测定具体方式为：依照RT 的制备方法，制备出IBVM-cDNA。 在此之后，实施十倍比例稀释。 取用2μL，将其视为模板。 在其余条件稳定情况之下，开展PCR 检测扩增。 将发生阳性反应条带模板用量最高稀释比例计算出最低IBV-M-cDNA 具体量[2]。

3 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR 检测方法取得的结果

鸡传染性支气管属于一种重大传染病。 当前兽医临床上并无典型的病变特点，所以说诊断较为困难。 现如今，常规化测定IBV 病毒实验室方法包含血清学、 病原学以及分子生物学方法。以上方式存在一定弊端， 有的方法进行时间达到几天以至于数周，比如说动物接种；有的需要较高细菌培养条件，比如血清中和试验[3]；而有的方法则存在非特异性反应以及敏感性低等等缺陷。

利用PCR 为核心的分子生物学检测方法，于IBV 早期诊断中能够取得满意效果。 和常规性血清学检测技术相比，这种方法的优势更多。 能够直接把病毒基因视为研究目标，继而更为精准可靠的鉴定病毒种类。 同时也有助于判断病毒流行病学情况。

有实验依照已经发表的IBV-M 基因序列内设计了一对具有特异性的引物。 其有着敏感性好、特异性高的特点。 创建出快速简便的RT-PCR 检测方式。 利用这种RT-PCR，能够从IBV 疫苗内扩增出目片段。 在相同的条件之下， 其余病毒诸如DHV、DRV、NDV 等等，均没有出现扩增出目的片段。 并且所测量的M基因全序列和发表的Mass41 中的M 基因相一致。这也在一定程度上证实了这种PCR 扩增技术用于鉴定IBV 病毒有着良好的可靠性和特异性。 值得进一步推广。