袁 曦 陈 群 何 倩 于冬梅 秦培武

摘    要：CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins）是細菌抵抗外来入侵的一种自适应免疫机制，利用CRISPR/Cas9系统可实现双链DNA的剪切并诱导宿主细胞DNA修复机制，从而达到靶向编辑基因的目的。核酸酶失活的Cas9（Nuclease-deactivated Cas9，dCas9）耦联效应分子可以调控靶标结合位点附近基因的表达、表观遗传修饰及特异染色体区域标记。目前已开发出多种CRISPR/Cas9系统，可对活细胞中重复或低重复序列基因位点进行实时多位点同步成像，广泛应用于动物和植物细胞中。基于CRISPR/Cas系统的活细胞染色体成像技术为研究活细胞染色体动力学和三维染色体结构提供了全新角度。本研究针对CRISPR/Cas系统的生源机制及其在活细胞成像的应用和发展现状进行概述，以期为该领域的相关研究提供参考。

关键词：CRISPR/Cas系统;活细胞;染色体;成像

中图分类号：Q789         文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.002

Application of CRISPR/Cas9 System in Living Cell Imaging

YUAN Xi， CHEN Qun， HE Qian， YU Dongmei， QIN Peiwu

（Center of Precision Medicine and Healthcare， Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute， Shenzhen， Guangdong 510855， China）

Abstract： CRISPR/Cas is a bacterial adaptive immune system. By cleaving specific strands of DNA and inducing DNA repair mechanism in host cells through CRISPR/Cas9 system， genome editing can be achieved. Nuclease-deactivated Cas9 （dCas9） can regulate gene expression， epigenetic modification， and label specific chromosomal regions via coupling effectors. Diverse CRISPR/Cas9 systems can target either the repetitive or low repetitive chromosome loci for live cell visualization， which is applicable to both animal and plant cells. Live cell chromosome imaging based on CRISPR/Cas system provides a new perspective for studying chromosome dynamics and three-dimensional genome structure. This review summarized the recent progress on the study of the molecular mechanism of CRISPR/Cas system and its application in living cell imaging.

Key words： CRISPR/Cas system; living cell; chromatin; imaging

1 CRISPR/Cas技术的作用原理

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是自然界中细菌抵御病毒侵染而进化产生的一种天然免疫系统，自2012年起被广泛应用于基因编辑研究中[1]。CRISPR/Cas（CRISPR-associated Proteins）系统在微生物中具备丰富的遗传多样性，已经发现的CRISPR/Cas系统可分为两大类，包括6种主要类型和33种亚型 [2]。每种CRISPR-Cas系统的组成结构各具特点，当前应用最广泛的是化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9）[3]。近年来，CRISPR/Cas系统在靶向基因编辑、基因激活和抑制、表观遗传修饰、全基因组筛选、RNA病毒检测和活细胞染色体成像等领域取得了一系列突破性进展[4-6]。

Cas9的免疫作用机制如图1所示：细菌初次被来自噬菌体或病毒的外源DNA侵染时，其CRISPR系统中的Cas1和Cas2酶识别并切割部……