潘慧芳

（清远市动物疫病预防控制中心 511500）

非洲猪瘟 （African swine fever，ASF） 是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。 该病病程短，死亡率高，对养猪业危害甚大，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病。ASFV 可感染家猪、野猪和软蜱，是唯一一种节肢动物作为传播媒介的DNA 病毒。 家猪感染后的临床表现和病理变化以及流行病学特点类似于急性猪瘟，但更为急剧，以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征，致死率高达100%[1]。2018 年8 月，辽宁省沈阳市确诊我国首例非洲猪瘟，至今全国所有省份都已出现非洲猪瘟疫情[2],对我国养猪业造成了巨大的经济损失。

目前， 各级兽医实验室主要采用荧光定量PCR 开展ASFV检测工作。 但在日常工作中，常常出现假阳性、阳性对照或阳性样品不显示Ct 值和检测样品无典型“S”形扩增曲线但其Ct 值显示为阳性等问题。 笔者通过查阅大量文献以及结合平时的工作经验，分析了上述问题的可能原因和解决方案。

1 荧光定量PCR 检测假阳性的原因与预防措施

据文献报道[3]，出现假阳性的主要原因有实验室检测功能区域设置不合理、检测人员、物品流向不合理、实验人员在核酸提取与试剂配制时未在独立的生物安全柜中进行、 实验人员操作不规范以及实验结束后清洁消毒不彻底等。 针对上述问题，应从实验室布局、检测人员自身和实验室生物安全方面进行改进。

1.1 完善实验室功能分区

从事分子生物学检测活动，微量的核酸污染即可严重影响试验结果的准确性。 在设计分子生物学实验室时，必须按照分子生物学试验的具体要求，将实验室严格分隔成试剂配制区、核酸提取区、 核酸扩增区、PCR 产物分析区等完全独立的功能室，做到对互不相容活动的相邻试验区域形成真正有效的隔离， 防止交叉污染的发生[3]。

1.2 检测人员正确规范操作

从事荧光定量PCR 试验的检测人员，必须经培训合格后上岗，切实掌握PCR 检测操作原理、方法和步骤，严格按照实验室建立的检测操作规程和试剂盒操作说明书进行各项实验活动。所有ASFV 检测的操作步骤必须在生物安全柜或者负压实验室进行处理，处理完毕之后，对操作台面和房间进行彻底消毒。 试验人员进入各个操作区域后，要严格单向移动，即试剂配制区→样品提取区→核酸扩增区→产物分析区，不得逆行。

PCR 扩增完成后， 尽量避免打开密封反应体系。 禁止把PCR 产物带到配制PCR 体系的区域内， 同时禁止在配制PCR反应体系的区域内，操作含核酸或质粒的溶液[3]。

1.3 做好实验室生物安全

荧光PCR 试验完毕后，必须对实验室环境彻底消毒。 生物安全柜和洁净工作台进行紫外照射消毒， 时间不低于30min，以破坏残留的核酸； 工作台面等用10%次氯酸或75%酒精等消毒液消毒；实验室内的样本液和扩增产物是气溶胶的主要污染源，故实验室要经常换气和消毒；所有试验区域，包括悬挂白大褂位置、放置高速离心机位置、放置PCR 仪等区域都要用可移动紫外线灯照射30min[2]。

2 荧光定量PCR 的Ct 值和荧光扩增曲线异常

在荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计， 荧光信号强度也等比例增加。 每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化， 从而得到荧光扩增曲线。 把PCR 反应的前6 个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 荧光阈值的默认设置是2～6 个循环本底荧光信号平均值的12 倍。 样品的荧光强度超过背景荧光值（荧光阈值）的时刻所对应的循环数，叫做Ct 值。

2.1 阳性对照或阳性样品不显示Ct 值及解决方案

日常检测非洲猪瘟样品时，常常出现阳性对照有典型的“S”型扩增曲线，但不显示Ct 值（Ct 值显示为Undetermined）。 有学者指出[4]，出现这种情况的主要原因是仪器默认的荧光阈值线过高。 解决方案：将荧光阈值一般设在PCR 指数扩增的起始，并高于阴性对照曲线。 其数值选择与试剂盒的性能有关，对荧光强度较高的扩增曲线， 阈值的设定不一定非要遵循固定的原则。 因此，针对试剂盒性能不同，实验室应建立自己的阈值范围，尽可能保证低值样本检测结果的稳定性[4]。

2.2 检测样品无典型“S”形扩增曲线，但其Ct 值显示为阳性及解决方案

实际检测过程中，也会遇到被检样品无典型“S”形扩增曲线，但其Ct 值显示为阳性（按照试剂盒说明书Ct 值判定标准）的情况。其他学者发现， 主要是被检样品不够新鲜或经反复冻融等导致的。 因此，被检样品要尽量新鲜，4℃～8℃保存的血清或抗凝血样品一般不超过120 h，唾液样品、组织样品冻融次数一般不超过3 次[4]。