贾丽媛，奚永志，孙玉英

1安徽医科大学307临床学院，北京 100071；2解放军总医院第五医学中心 免疫学实验室，北京 100071

原因不明复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)是指与同一配偶连续发生3次或3次以上的自然流产(孕龄小于12周)，并排除已知病因，如遗传背景异常、内分泌失调、生殖系统感染、生殖器官畸形、自身免疫疾病以及凝血功能异常等，占妊娠总数的1% ～ 5%[1]。URSA发病机制尚不明确，但是既往研究发现其多与免疫学因素有关[2]。由于胚胎及滋养细胞有来自父系的遗传物质，妊娠类似于同种异体移植。正常妊娠中，母体免疫系统对半相合同种异体胚胎产生的特异性免疫抑制物(封闭抗体、dNK细胞等)以及免疫激活物(如辅助性T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、补体等)共同构成免疫耐受平衡系统，形成母体对胚胎免疫耐受的平衡状态[3]。URSA是妊娠母体中母胎免疫耐受平衡状态被打破而造成母体对胚胎免疫排斥的结果。近年研究表明，固有免疫系统和获得性免疫系统中关键细胞及其细胞因子异常均会造成母体与胎儿间免疫耐受失衡而产生免疫排斥，并致流产的发生[4-5]。因此，本文就固有免疫系统与获得性免疫系统中关键分子异常对URSA发病机制影响的研究进展做如下综述。

1 固有免疫系统

1.1 自然杀伤细胞 自然杀伤(natural killer，NK)细胞是机体的固有免疫细胞，在非妊娠健康人体内主要存在于外周血液循环中。外周血NK(peripheral NK，pNK)细胞主要是CD56dimCD16+NK细胞，无需主要组织相容性复合体特异性限制即可激活抗体依赖的细胞毒反应，对抗肿瘤和感染。Muyayalo等[6]最早发现URSA患者外周血pNK细胞水平明显上升，表明URSA的发生与pNK细胞介导的细胞毒作用增强有一定关系，也可能由NK细胞分泌过多杀伤因子而导致胚胎种植失败。Seshadri和Sunkara[7]的Meta分析也显示，URSA患者的pNK细胞水平明显高于健康妊娠者。因此，对于有URSA病史的患者，pNK细胞数量的提升可能预示着随后的流产。此外，pNK细胞产生的促炎和抗炎因子在有反复流产史的女性中也存在代谢紊乱的情况，但其潜在的分子机制尚不清楚，需要进一步的研究加以阐明[8]。

蜕膜NK(decidua NK，dNK)细胞多为CD56+CD16-NK细胞，占子宫淋巴细胞比例最多(70% ～90%)，主要存在于子宫内膜和蜕膜中。dNK细胞膜表面表达多种抑制性受体(NKG2C、NKG2E和KIR)和激活性受体(NKp30、NKp40和NKp46)。正常妊娠过程中，占优势的是dNK抑制性受体，抑制其发挥细胞毒性，保护胚胎发育[9]。如果dNK激活性受体异常表达，激活dNK细胞发挥杀伤活性，杀伤胚胎细胞导致流产[9-10]。Wang等[11]检测URSA蜕膜dNK细胞中KIR表达水平，发现KIR2DL1/S1在CD56+CD16-NK细胞中的表达明显低于对照组(P=0.026)，并推测抑制性受体KIR的特异性表达降低可能是URSA发生胚胎丢失的免疫机制。

研究表明，蜕膜dNK细胞明显增高与URSA发生相关。Kuon等[12]用免疫组化方法评估URSA的dNK细胞数量水平，发现URSA的dNK细胞明显高于正常对照组(P=0.04)。研究还发现，外周血淋巴细胞CD45+CD3-DR+(P＜0.01)和CD45+CD3+CD8+DR+(P=0.04)的数目越高，dNK细胞数也越高，其高相关性提示激活的成熟免疫细胞可能为dNK细胞的分化提供细胞因子。同时，Toth等[13]研究发现，与原发性URSA(无既往活产史)相比，继发性URSA组(有既往活产史)的dNK细胞数量水平较高(P=0.044)，而pNK细胞水平较低。由此可见，原发性和继发性URSA的NK细胞水平也存在差异，需要深入探究以阐明pNK和dNK细胞的数量与功能变化在URSA发病中的作用。

近些年不少研究者提议，根据dNK细胞的数量水平可将URSA分为低、正常和高dNK细胞水平组[14]。通过对不同dNK细胞水平的URSA患者妊娠结果随访，探究其与URSA风险的关系。但是，目前对于正常妊娠母体的dNK细胞的正常值范围并没有明确的临界值，不同研究对于高水平dNK细胞的判断标准也不尽相同。Quenby等[15]将dNK细胞占蜕膜细胞的5%定义为危险临界值，超过该值将易导致URSA的发生；而Teklenburg等[16]将易发生URSA的dNK细胞比例界定为12.9%。因此，对于URSA患者的dNK细胞数量水平的范围界定尚需大量病例对照研究和质量控制标准化。

1.2 巨噬细胞 巨噬细胞可通过识别病原体产生大量的细胞因子和趋化因子，并将病原体加工并呈递给CD4+T细胞，从而将固有与适应性免疫系统联系起来。作为正常妊娠过程中最主要的抗原提呈细胞之一，其细胞功能或所分泌细胞因子的改变均会影响母胎界面免疫耐受平衡状态的维持[17]。对于不同的外界刺激，巨噬细胞可以分化为M1和M2两型。M1型是有抗原提呈功能的促炎性反应细胞，可分泌大量促炎性细胞因子，如TNF-α等[18]；M2型具有诱导免疫耐受特性，分泌抗炎性细胞因子IL-10，在抑制寄生虫、组织重建和免疫调节功能中发挥重要作用[19-20]。已有研究表明，URSA母胎界面的巨噬细胞数量增加，并且多伴随高水平炎性因子和抗肿瘤活性的M1激活[21-22]。Wang等[23]认为，M1型巨噬细胞异常活化和IL-10表达水平降低是由Treg细胞通过细胞间接触和分泌TGF-β介导的机制引起的。Kolben等[21]认为是M1型巨噬细胞激活现象与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAPγ)表达受到抑制有关，PPAPγ表达升高可减轻母胎界面炎症反应。Goto等[24]认为URSA与巨噬细胞中组织蛋白酶E(CatE)有关，URSA患者蜕膜巨噬细胞产生的组织蛋白酶E活性显著下降。同时，URSA小鼠模型也显示CatE(-/-)小鼠虽可生育，但产仔数显著减少[24]。由此可见，在URSA发病机制中巨噬细胞的作用不可忽视。

1.3 树突状细胞 树突状细胞(dendritic cell，DC)作为启动和调控适应性免疫的始动环节，是目前已知功能最强的抗原提呈细胞。研究发现其不仅能够活化机体免疫应答抵抗外来微生物入侵，在妊娠过程诱导免疫耐受中也发挥重要作用，其介导的耐受机制主要体现在诱导T细胞的免疫耐受。DC通过诱导T细胞无能、介导T细胞克隆清除、调节T细胞亚群分化及诱导调节性Treg产生等机制而产生T细胞无反应性。如果DC亚群及其功能异常，通过刺激T细胞增殖分化，激活炎症免疫反应而攻击胚胎，这可能是导致URSA发生的机制之一[25]。

DC细胞根据其分化程度分为非成熟DC(iDC)和成熟DC(mDC)。mDC高表达共刺激信号(如CD80/CD86、CD40、 细 胞 间 黏 附 分 子 1)和MHC-Ⅱ类分子；而iDC仅低表达MHC-Ⅱ类分子，不表达或低表达共刺激分子。Qian等[26]采用免疫组化染色技术发现，在30个随机选择的高倍视野(HPF)中，URSA患者蜕膜组中mDC比例(14.20±13.34/30 HPF)显著高于正常早孕妇女(4.77±2.64/30 HPF，P=0.001)。Huang等[27]通过流式细胞术进一步佐证mDC数量的增加与URSA显著相关(OR：1.14，95% CI，1.01 ～ 1.29，P＜ 0.05)。 当 DC 细胞向T细胞提呈抗原时，DC表面的CD80/CD86与T细胞膜上CD28结合，作为T细胞激活的第二信号协同刺激T细胞活化和分化。Jin等[28]在URSA流产模型小鼠孕第4天植入抗CD80和抗CD86单克隆抗体，发现孕鼠外周血Th1型细胞因子分泌显著减少，小鼠胚胎丢失率(8.64%)明显低于对照组(26.67%)，表明DC细胞膜的CD80/CD86表达水平与母胎界面的免疫耐受程度呈负相关，不利于胚胎发育。

免疫球蛋白样转录物4(immunoglobulin-like transcript 4，ILT4)是免疫球蛋白(Ig)基因超家族的成员之一，在DC细胞中与HLA-G相互作用可以启动与免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)相关的细胞内信号传导的级联反应。ILT4可通过ITIM诱导SHP-1磷酸酶去磷酸化和NF-κB钙依赖性下调，随后导致共刺激分子CD80和CD86在DC中的表达降低。Liu等[29]研究发现反复流产组女性外周血和子宫内膜中的ILT4+DC减少，并猜测ILT4+DC是通过诱导Foxp3+Treg细胞在维持免疫耐受中发挥作用；而子宫内膜ILT4与Foxp3表达之间存在密切关系[30]。由此可见，DC的功能改变与免疫耐受失衡密切相关，DC亚群变化及表面功能分子表达差异可能是URSA发病机制之一。

1.4 补体 补体具有酶活性，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，其广泛存在于机体血液、组织、妊娠母胎界面，在机体的防御功能、调节免疫系统功能以及免疫病理中发挥重要作用。正常妊娠过程中，一定程度的补体成分激活对胎儿及妊娠附属物的正常发育是必需的，如滋养层一定水平的补体有助于胎盘对病原体的免疫防御、滋养细胞迁移和新血管生成[31-32]。Huang等[33]通过对子宫内膜基因的表达分析发现，补体级联通路在URSA中显著下调。与正常组相比，URSA患者子宫内膜的补体C3、C4、C4BP、DAF、DF、SERPING1表达水平显著下降。也有研究认为，URSA患者蜕膜组织中存在补体异常激活，蜕膜中高水平补体能与募集的中性粒细胞和单核细胞表面结合，激活细胞炎症通路，引起胚胎组织炎症、缺血以及坏死。Ohmura等[34]认为URSA患者体内存在高滴度水平的抗C1q抗体，激活了母胎界面的补体经典激活途径，从而导致胎盘损伤和胚胎丢失。C4d是补体激活经典途径的非功能性分裂产物，其附着于细胞和组织，在移植、妊娠、自身免疫等疾病中被认为是同种异体排斥反应的潜在生物标记物[35]。Meuleman等[36]研究发现，与散发性流产和人工流产的女性相比，URSA妇女合体滋养细胞的C4d沉积显著增加，导致胚胎丢失的原因是由于蜕膜补体过度激活。由此可见，补体含量过低或异常激活对妊娠都是不利的，补体活化和补体抑制因子的动态平衡是成功妊娠的必要条件。补体系统由于其复杂的级联反应常被研究者回避，但URSA患者体内的补体异常激活反应，为妊娠失败提供了治疗新靶点。因此，对于补体与URSA之间的关联性还需进一步研究与发掘。

2 获得性免疫系统

2.1 封闭因子 正常妊娠中，父系淋巴细胞表面抗原可刺激母体产生称为封闭抗体(blocking antibody，BA)的相应抗体并与胚胎滋养细胞的父系抗原形成封闭，保护胚胎免受母体滋养层免疫细胞的损伤。目前临床多认为URSA的发生与患者缺乏BA有关。若妊娠时母体缺乏足够的BA，可引起母体同种免疫识别保护功能低下，易对胎儿发生异物排斥反应，从而造成流产。国内外研究发现，对缺乏BA的复发性流产患者应用同种异体淋巴细胞免疫治疗(lymphocyte immunology therapy，LIT)可以诱导封闭抗体阳性率显著提高，再次妊娠的成功率可达89.7%，显著高于未治疗的URSA患者[37-38]。对于URSA患者封闭抗体水平的评估，Yuan等[39]通过单向混合淋巴细胞反应封闭效率实验(MLC-BE)来评价BA阳性率，发现MLC-BE阳性率在LIT治疗后(58.1%)明显高于治疗前(16.2%)，特异性封闭抗体(anti-idio blocking antibody，BEAb2)阳性率从11.1%提升到47%，而且治疗后妊娠成功率达到73.5%。这说明异基因淋巴细胞主动免疫治疗能显著提高URSA患者体内BA阳性率以及妊娠成功率。

群体反应性抗体(panel reactive antibodies，PRA)是血清中一类专门针对人类白细胞抗原(HLA)的封闭抗体，任兴斌和张伟[40]用酶联免疫方法检测URSA患者经主动免疫治疗前后PRA的变化，发现URSA患者经免疫治疗后妊娠组血清PRA阳性率较免疫治疗后未孕组明显提高(P＜0.01)。这提示URSA患者经主动免疫治疗后，在提升自身免疫耐受和免疫抑制功能的同时，产生了针对其配偶HLA抗原的封闭抗体，抑制了URSA患者对其胚胎父系抗原的处理和提呈。因此，PRA下调了免疫应答强度，对抑制URSA的发生及后续的妊娠成功起到了重要作用。所以，对原因不明复发性自然流产患者应及早筛查PRA，并在主动免疫治疗后及时检测PRA的变化，观察患者机体免疫耐受状态，为治疗赢得最佳时机，并有效提升治疗成功率。

2.2 CD4+T细胞亚群及其细胞因子 在不同细胞因子诱导刺激下，初始CD4+T细胞可分化为Th1、Th2、Th17以及Treg等成熟淋巴细胞。研究发现Th1、Th2、Th17、Treg细胞及其分泌因子均参与母胎免疫耐受调节。Th1细胞分泌IL-2等促炎性细胞因子，介导和调控机体炎症效应，对滋养层细胞产生细胞毒性。Th2细胞分泌IL-4等促进抗体生成的细胞因子，增强抗体介导的体液免疫应答，促进免疫耐受状态的形成。因此母体对胎儿的识别及妊娠的维持主要通过占优势的Th2型细胞因子来实现。正常妊娠中，Th1细胞和Th2细胞通过细胞因子和细胞间信号传导进行交互作用，处于相对平衡状态。Liu等[41]通过流式细胞技术对临床治疗有效组和未治疗组URSA患者外周血细胞因子水平进行检测显示，有效治疗组外周血Th1/Th2细胞比例水平显著低于未治疗组。说明经过免疫治疗后，URSA患者体内炎症免疫反应降低，免疫耐受机制增强。这进一步说明妊娠的成功依赖于母体Th1/Th2细胞的平衡。

同时，大量研究表明Th17/Treg细胞平衡也与URSA的发病机制有关。Th17细胞表达IL-17、IL-17A、IL-22等，其中IL-17可诱导分泌多种炎性细胞因子(如集落刺激因子G-CSF、巨噬细胞炎性蛋白MIP-2、单核细胞趋化蛋白MCP-1、IL-8)，召集中性粒细胞浸润而损伤胚胎。Treg细胞通过分泌TGF-β、IL-10，特异性表达FoxP3，抑制CD4+和CD8+T细胞增殖和效应功能，阻止炎症反应，维持免疫耐受。罗娜等[42]通过流式细胞技术发现，与早孕组和未孕组相比，URSA组的Th17和Th17/Treg水平显著上升，Treg细胞含量明显降低(P均＜0.01)。Ahmadi等[43]发现，经有效治疗后的URSA患者外周血Th17细胞比例和功能显著下降，Treg细胞呈上升趋势；Th17细胞介导的炎症反应下降，Treg细胞发挥抑制免疫排斥作用增强，趋向母胎免疫耐受状态。

Roomandeh等[44]通过ELISA方法检测URSA外周血中IL-17、IL-17A、IL-22、TGF-β、IL-10表达水平发现，URSA外周血中Th17细胞分泌促炎因子IL-17、IL-17A、IL-22的血清浓度明显高于正常妊娠组(P＜0.001，P=0.01，P＜0.001)，Treg细胞分泌TGF-β水平降低(P=0.02)，Th17和Treg细胞的功能性改变进一步验证了Th17/Treg偏移可能导致URSA的反复自然流产。Zenclussen[45]通过对自然流产模型孕鼠注射体外扩增的经妊娠诱导的CD4+CD25+Treg细胞发现，孕鼠胚胎丢失率明显减少，说明Treg细胞在维持妊娠中发挥重要作用且必不可少。以上研究均提示，Th1、Th2、Th17、Treg细胞及其细胞因子对母体维持妊娠是十分重要的。临床上可进行检测外周血或蜕膜中辅助性T细胞亚群变化，以判断子宫免疫系统和免疫耐受微环境是否异常，作为预测流产发生的危险因素。

3 结语

固有免疫系统与获得性免疫系统中关键分子异常对URSA发病机制影响的研究已经取得了较大的进展，但仍存在一些相互矛盾的结论以及待阐明的问题。为形成一个科学、系统的URSA发病理论体系，尚需在如下方面对研究进行严格的规范：1)应确定URSA的筛查标准，如流产次数、孕龄、是否为同一配偶以及排除其他非同种异体免疫学因素等，以提高研究对象的同质性。2)采用先进的科学分析技术，如基因组学，转录组学以及蛋白组学等技术，精准研究URSA的发病机制，精确定位URSA的诊疗靶标。3)要多中心广泛联合研究，结合大样本大数据，以期最终揭示免疫学因素在URSA发病机制中的重要作用。通过以上研究，最终形成科学系统的URSA发病理论体系，为该病的特异高效诊疗提供坚实的实验及理论基础以及新靶标和新途径。