高效液相色谱法测定乳粉中VK2（七烯甲萘醌）含量

2020-01-18王瑶张敏马晓冲刘星柴艳兵张耀广李飞李兴佳

乳业科学与技术 2019年6期

王瑶，张敏，马晓冲，刘星，柴艳兵*，张耀广，李飞，李兴佳

（君乐宝乳业集团质量管理中心，河北石家庄050021）

维生素K2，亦称甲萘醌，是自然界中VK的主要存在形式之一[1-2]。VK2通过激活r-谷氨酸羧化酶促进VK依赖性蛋白前体谷氨酸残基（Glu）羧化为r-羧基谷氨酸（Gla），使蛋白质发挥生物活性功能，对改善骨密度、促进骨细胞生长、调节T细胞、防止血管硬化和止血等有重要作用[3-6]，是人体不可缺少的重要维生素之一。研究表明，母乳喂养的婴儿具有有限的VK来源，因为母体通过胎盘传输给婴儿的VK较少且在人乳中以非常低的含量（（5.170±1.521） μg/L）存在[7]，孕妇及婴幼儿已经成为VK严重缺乏人群[8]。VK2是唯一具有生物活性的VK，VK1、VK3只有在肝脏中转化为VK2后才能和胃肠微生物产生的VK2一起被人体吸收利用[9]。因此，VK2得到越来越多国内外研究者的关注。目前，在乳粉中广泛添加VK1，补充人体VK摄入的不足。但随着对VK2研究的深入，一些企业推出添加VK2的乳粉产品，得到国家高度重视。目前我国尚未有乳粉中VK2的国家检测标准，因此需建立VK2的测定方法，以保障乳粉产品质量。

目前，VK2的检测方法主要有液相色谱法[10-13]、毛细管电泳法[14]、液相色谱-串联质谱法[15-16]等。七烯甲萘醌（menaquinone-7，MK-7）是VK2的一个类型，即VK2侧链上含有7 个异戊二烯单元，是一种脂溶性维生素[17]。所有VK的结构相似，但侧链长度不同。侧链越长，人体吸收性越好、生物活性越高[18]。因此，长链的甲萘醌（特别是MK-7）是最优质的，因为它们能几乎完全被人体吸收。本研究建立一种采用高效液相色谱法测定乳粉中MK-7含量的方法，为乳粉质量管控提供科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

含VK2乳粉君乐宝乳业有限公司。

MK-7标准品（纯度大于98%）日本富士和光纯药公司；甲醇（色谱级）德国默克公司；异丙醇、正己烷（均为色谱级）中国迪马科技有限公司；无水乙醇（色谱级）天津福晨化学试剂有限公司；碳酸钾（分析纯）天津永大化学试剂厂；脂肪酶（酶活力≥700 U/mg）美国Sigma公司；实验用水均为超纯水（18.0 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪（配备荧光检测器）美国安捷伦公司；Milli-Q ZMQS50001超纯水机美国密理博公司；LYNX4000高速落地离心机赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ME203E/02电子分析天平瑞士梅特勒-托利多公司；RE311旋转蒸发仪重庆雅马拓有限公司；DKZ-ZB恒温水浴振荡器上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

MK-7标准储备液（1 mg/mL）：称取MK-7 10 mg（精确至0.1 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，用2 mL异丙醇溶解并用甲醇定容，摇匀，制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4 ℃避光保存，使用期限6 个月。

MK-7标准中间溶液（10.0 μg/mL）：准确吸取100 μL 1 mg/mL的MK-7标准储备液，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃避光保存，使用期限3 个月。

MK-7标准工作溶液：分别准确吸取0、20、50、80、100、150 μL 10.0 μg/mL MK-7标准中间溶液，用甲醇-异丙醇（4∶1，V/V）溶液定容至1 mL，配制成质量浓度分别为0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μg/mL的标准工作溶液，现用现配。

1.3.2 样品前处理

称取混合均匀的固体试样2 g（精确到0.01 g）于离心管中，用10 mL温水溶解；向上述试样溶液中加入一定量脂肪酶，于（37±5） ℃恒温水浴振荡器中振荡，使其充分酶解；取出酶解好的试样，依次加入5 mL无水乙醇和一定量碳酸钾，充分混匀；加入20 mL提取溶剂，充分振摇后5 000 r/min离心5 min，取出上层清液，置于另一离心管中，再加入10 mL提取溶剂重复操作1 次，合并上清液；在离心管中加入5 mL超纯水清洗上清液，取出上层清液于旋转蒸发瓶中，在旋转蒸发器上于（40±2） ℃条件下蒸发至干；准确加入1 mL甲醇-异丙醇（4∶1，V/V）溶液复溶，充分振荡溶解残留物，过0.22 μm有机滤膜后上机检测。

对脂肪酶添加量、酶解时间、碳酸钾添加量及提取溶剂进行优化。

1.3.2.1 脂肪酶添加量与酶解时间优化

乳粉中脂质丰富，MK-7是脂溶性维生素，因此前处理时加入脂肪酶降解试样中的脂肪和不饱和脂肪酸是必要的。脂肪酶添加量及振荡酶解时间均会影响MK-7的提取，以MK-7加标回收率为指标对脂肪酶添加量（0、250、500、750 mg/g）与酶解时间（1、2、4、6、12 h）进行优化。MK-7加标回收率按式（1）计算。

式中：C1为试样中MK-7含量/（μg/100 g）；C2为MK-7添加量/（μg/100 g）。

1.3.2.2 碳酸钾添加量优化

皂化反应指碱和酯反应生成醇和羧酸盐的反应。乳粉经过皂化反应，酶解后的脂肪生成脂肪酸盐溶解于水相中，与VK2分离[19]，但VK2对碱敏感[20]，碱的添加量会影响VK2的回收率。以MK-7加标回收率为指标对碳酸钾添加量进行优化。

1.3.2.3 提取溶剂优化

VK2在丙酮、正己烷和甲醇中均可溶解。以MK-7加标回收率为指标对3 种提取溶剂进行优化。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或具有同等性能的色谱柱；还原柱（4.0 mm×15 mm）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样体积10 μL；运行时间30 min；检测波长：激发波长243 nm，发射波长430 nm；流动相：甲醇-异丙醇（4∶1，V/V）。

1.3.4 MK-7含量计算

试样中MK-7的含量按式（2）计算。

式中：C为试样中MK-7的含量/（μg/100 g）；ρ为试样溶液中MK-7的质量浓度/（μg/mL）；V为复溶残余物的定容体积/mL；m为试样质量/g；100为换算系数。

1.3.5 灵敏度、准确度和精密度考察

向空白样品中添加适量MK-7标准溶液，经上述方法测定，测定色谱峰信噪比（RS/N），RS/N＞3对应的MK-7含量为方法检出限，RS/N＞10对应的MK-7含量为方法定量限。

选择不含MK-7的样品，分别添加5、10、25 μg/100 g的MK-7，每个添加量6 个平行试样，按优化后的方法提取和测定，计算加标回收率，考察方法准确度；计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法精密度。

1.4 数据处理

使用Origin 9.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 酶解条件选择

图1 脂肪酶添加量对MK-7加标回收率的影响Fig. 1Effect of lipase addition on recovery of MK-7

由图1可知，样品前处理不添加脂肪酶时，MK-7加标回收率仅为1.26%；而脂肪酶添加量为250 mg/g时，加标回收率可达87.66%，因此前处理时加入脂肪酶是必要的。脂肪酶添加量为250、500、750 mg/g时，MK-7加标回收率分别为87.66%、81.05%、86.61%，相差不大。综合考虑经济效益后确定脂肪酶添加量为250 mg/g。

由图2可知：酶解1 h时MK-7加标回收率为45.01%，酶解12 h时MK-7加标回收率为74.93%，均明显低于其他酶解时间；酶解时间为2、4、6 h时，MK-7加标回收率分别为87.66%、81.70%、88.40%，相差不大，而酶解12 h会大大降低检测效率，因此，综合考虑选择酶解时间为2 h。

图2 酶解时间对MK-7加标回收率的影响Fig. 2Effect of hydrolysis time on recovery of MK-7

2.1.2 皂化条件选择

图3 碳酸钾添加量对MK-7加标回收率的影响Fig. 3 Effect of potassium carbonate on recovery of MK-7

由图3可知：碳酸钾添加量为250 mg/g时，MK-7加标回收率偏低，为78.10%，可能是由于皂化不完全；碳酸钾添加量为500 mg/g时，MK-7加标回收率最高，为87.66%；再增加碳酸钾添加量时，MK-7加标回收率开始逐渐降低。因此选择碳酸钾添加量为500 mg/g。

2.1.3 提取溶剂选择

图4 提取溶剂对MK-7加标回收率的影响Fig. 4 Effect of extraction solvents on recovery of MK-7

由图4可知：甲醇作为提取溶剂时，MK-7加标回收率仅为0.31%，不适合提取乳粉中的MK-7；丙酮作为提取溶剂时，MK-7加标回收率为79.91%，略低于正己烷作为提取溶剂时的加标回收率（87.76%），因此选择正己烷作为提取溶剂。

2.2 分离度测定结果

VK的不饱和酮结构共轭体系较小，不能产生荧光，但能通过衍生使VK同系物母核萘醌环产生荧光[21]。VK在分离色谱柱之后经过还原色谱柱被还原，对还原型VK使用荧光检测器进行检测。

图5 MK-7标准溶液（1.5 μg/mL）及样品高效液相色谱图Fig. 5 Chromatograms of MK-7 standard solution (1.5 μg/mL) and samples

由图5可知，MK-7峰与相邻峰有较好的分离度，容易辨识。

2.3 标准曲线绘制

对质量浓度分别为0.0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μg/mL的MK-7标准工作溶液进行上机检测，以目标峰面积为纵坐标，以MK-7标准工作溶液质量浓度为横坐标，建立标准曲线方程。结果表明，在MK-7标准工作溶液质量浓度0.0～1.5 μg/mL范围内，标准曲线方程为y=229.430x-0.894（R2=0.999 95），线性关系良好。