张立春 ，李梦姝，，张珈溯，云巾宴，柳俭强，曹 阳，金海国，夏广军*

(1.吉林省农业科学院畜牧分院，吉林公主岭 136100；2.延边大学农学院，吉林延吉 130021；3.长春金赛药业股份有限公司，吉林长春 130012)

血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）属I 型分泌性糖蛋白，分子量在34～45 KD 之间，其主要生理功能包括促进血管内皮细胞增殖、增强血管通透性、改变细胞外基质及诱导血管生成等[1]。目前发现的人VEGF 家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盘生长因子（Placenta growth factor，PGF）[2]。VEGF-B 氨基酸组成及空间结构与VEGF-A 相似，又被称为VEGF 相关因子[3]。人VEGF-B基因含有6 个外显子，其中外显子6 可发生可变剪切生成2 种变异体VEGF-B167 和186[3]。人和小鼠VEGF-B基因具有广谱的组织分布特性[4-5]，但在小鼠心脏、骨骼肌中高表达[4]，人中除心脏和骨骼肌外，还在脂肪组织及血管中高表达[5]，提示物种间VEGF-B 的差异性。由此推测VEGF-B基因在心脏血管发育及诱导心肌肥大等方面发挥作用[6]。另外与VEGF 家族其他成员所不同的是VEGF-B 并不表现出明显的肿瘤促进功能，而表现在能量代谢、神经保护方面，进一步提示VEGF 家族成员功能的差异性[7]。

VEGF-B基因可在皮肤组织中表达，但在EGF 和TGF-β1 刺激情况下，皮肤成纤维细胞中VEGF-B 敏感性要高于胶质细胞[8]。皮肤成纤维细胞中尽管VEGF-B缺失并不影响受损皮肤组织血管修复[9]，但通过转基因方法表达VEGF-B 却可加快皮肤组织血管恢复[10]。目前除VEGF-A 外，其他VEGF 家族成员并未有直接证据证明参与毛囊毛发发育[11]。课题组前期研究证明新吉细毛羊在毛用性状相关指标上显著优于小尾寒羊，其潜在影响因素在于皮肤毛囊组织功能差异[12]。进一步在绵羊皮肤组织中相继克隆出VEGF 家族A、C、D和PGF基因[13-16]，并揭示不同家族成员在皮肤组织中通过可变剪切（Alternative Splicing,AS）产生多种类型转录本[13-15]。本文进一步以小尾寒羊与新吉细毛羊为研究对象，克隆绵羊VEGF-B基因并进行系统分析，为系统了解绵羊VEGF 基因家族在皮肤组织中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RNAlater 购置于QIAGEN 公司、Trizol购自于Invitrogen 公司；pMD18-T 载体、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit 和Ex Taq 酶均购自大连Ta KaRa 公司；大肠杆菌工程菌DH5α为本实验室保存。

1.2 实验样品采集 本实验动物为前期研究相同实验群体与实验样品[11]。

1.3 引物设计与合成 由于目前GenBank 数据库中尚未有绵羊VEGF-B基因mRNA 数据信息，仅有预测的cDNA 序列，本实验以预测序列为模板，设计引物，引物序列参见表1。引物合成委托北京华大基因生物公司完成。

表1 引物序列及扩增条件

1.4 皮肤总RNA 提取与cDNA 一链合成 皮肤总RNA提取采用液氮研磨，Trizol 法提取。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后-80℃保存备用。cDNA 第一链合成反应参照PrimeScript 反转录试剂盒进行，具体步骤按说明书进行。

1.5 RT-PCR 与基因克隆 RT-PCR 扩增体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5μL，sVEGF-B_C 上 下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.5 U/μL Taq 酶0.2 μL，cDNA 模 板1 μL，ddH2O 17.8μL。反应条件为94℃预变性2 min，扩增程序为94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共35 个循环，最后72℃ 5 min 延伸。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、胶回收和T 载体连接等后续实验，阳性菌落送生物公司完成测序反应，测序结果进行生物信息学分析。

1.6 生物信息学分析 测序结果首先用DNASTAR7.0软件包Seqmen 进行序列拼接，拼接序列利用Blast N在GenBank 数据库进行序列比对。核酸及氨基酸多序列比对采用DNAman 9.0 软件进行。可变剪切分析主要将所获得的序列与绵羊基因组数据比对，并参照比对结果绘制可变剪切模式图。蛋白序列功能结构域分析采用SMART 在线数据库分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）。蛋白氨基酸序列酶切位点分析采用PeptideCutter进行（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）。

1.7 不同组织器官VEGF-B 可变剪切体分布与表达分析 不同组织器官VEGF-B 可变剪切体分布检验通过设计不同可变剪切体检测引物（表1），以不同绵羊组织器官cDNA 为模板，采用RT-PCR 方法检验不同组织器官中可变剪切体是否存在特异性分布情况。不同组织器官表达谱分析则在保守区设计qRT-PCR 引物（表1），采用罗氏light cycle 480 II 机器进行。反应体系（20 μL）：ddH2O 8.6 μL，cDNA 模 板1μL，Light cycler 480 SYBR Green I master 10 μL，正、反向引物各0.2 μL。PCR 反应 条 件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，共40个循环，扩增反应结束后进行熔解曲线分析。每个品种检测2 个个体，每个样品重复进行3 次。以GAPDH 引物为内参，检测结果利用2-△△Ct法进行数据分析并绘制柱形图。

2 实验结果

2.1 绵羊VEGF-B基因克隆与序列分析 以小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织cDNA 为模板，经RT-PCR 扩增，电泳检测显示成功扩增出目的条带，但不同个体间存在大小差异（图1）。考虑到VEGF-B基因可能存在可变剪切，将扩增电泳条带全部回收、克隆测序分析，Blast N 比对结果显示所回收的扩增片段均为VEGF-B基因，与参考序列同源性均在98% 以上。所获得的扩增片段大小依次为978 bp 和877 bp，分别命名为X-B4、X-B7 和S-C1。其中X-B4 与参考序列（序列号：XM_012117071.2）相同，为VEGF-B基因预测突变体X2。X-B7 和S-C1 片段中间区出现101 bp 的片段缺失（图2），与VEGF-B基因预测突变体X3 序列相同（序列号：XM_012117072.2）。

进一步序列分析发现，本实验所克隆到的VEGF-B基因并不包含完整的ORF 框，氨基酸序列比对发现本实验所获得的2 种类型VEGF-B基因编码蛋白C 端氨基酸序列差异较大，从本质上说已完全不属于同一蛋白（图3），但Blast P 结果发现X-B4 编码氨基酸序列除与突变体X2 相同外，还与牛VEGF-B186 高度同源。X-B7 和S-C1 所编码氨基酸序列除与突变体X3 相同外，也与牛VEGF-B基因氨基酸序列高度同源，一方面说明牛羊之间VEGF-B基因亲缘关系较近，另一方面也说明本实验所克隆到的VEGF-B基因2 种类型可变剪切模式具有物种间的普遍性[17]。SMART 分析结果显示2 种类型氨基酸序列突变均未造成PDGF 功能结构域的改变，影响的仅是蛋白C 末端长度及结构性改变，推测可能并不能从根本上改变VEGF-B 功能，目前尚不清楚绵羊VEGF-B不同突变类型的功能及产生机制。

VEGF 家族蛋白成熟过程需要经历N 端及C 端前导肽的蛋白水解过程。本实验中所发现的2 种类型VEGF-B 蛋白C 末端氨基酸差异性是否影响蛋白水解，利用PeptideCutter 在线分析程序对X-B4 和X-B7部分氨基酸序列进行蛋白酶位点预测发现，2 种类型VEGF-B 氨基酸序列蛋白酶预测位点存在明显变化（图4、表2），其中X-B4 氨基酸序列中Proteinase K和Thermolysin 酶切位点数量明显增加，X-B7 氨基酸序列中Arg-C proteinase、Clostripain、NTCB（2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid）和Trypsin 酶切位点数量明显增加，提示2 种类型VEGF-B 蛋白在水解加工过程中可能存在差异。

表2 X-B4 与X-B7 氨基酸C 末端段蛋白酶切位点预测结果

2.2 不同组织器官VEGF-B基因可变剪接体突变体表达模式分析 鉴于在绵羊皮肤组织中所克隆到的VEGF-B基因存在2 种类型的可变剪切突变体，为探讨该突变体是否具有组织特异性，本实验设计可变剪切体检测引物，以小尾寒羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、肠道、肌肉、卵巢和脑组织cDNA 为模板，通过RT-PCR 法检测不同器官的VEGF-B基因的可变剪切类型（图5）。结果显示在小尾寒羊个体各个组织中均有表达，片段大小与预测相同，但在肠道组织、卵巢及皮肤组织中还扩增出一条150 bp 左右的特异性条带，目前尚不清楚该条带是非特异性扩增还是该组织中存在其他不同类型的突变体mRNA（图5）。同时值得注意的是在心脏组织中出现一条较为特异的扩增条带，较877 bp 检测片段稍小，考虑到PCR 扩增反应特异性较强，且其他组织中并未发现类似扩增产物，推测肠道、卵巢和皮肤以及心脏组织VEGF-B基因可能存在组织特异性的可变剪切方式。

2.3 不同组织器官VEGF-B基因表达谱分析VEGF-B基因不同AS 类型在组织器官特异性检测发现仅存在轻微差异，为进一步检验该基因在不同组织器官中的表达差异，本实验选取2 头成年小尾寒羊个体，利用qRTPCR 法检验心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、肌肉、卵巢和脑组织中的相对表达水平，并以心脏组织为参照，绘制VEGF-B基因在不同组织器官中的相对表达量柱形图（图6）。结果发现VEGF-B在不同组织器官中的表达量变异较大，其中脾脏和肾脏相对心脏表达量略高，大约为心脏表达水平的1.5 倍。肺脏与卵巢组织中则明显高于心脏组织，相对表达量依次为5.3 倍和2.3 倍。与上述组织相反，肠道、肝脏、肌肉和脑组织中VEGF-B基因表达量较心脏组织表达量下调，其中肝脏组织和脑组织相对表达量仅为心脏组织的20%左右，肌肉则更低，相对表达量仅为8%。肠道组织相对表达降低则不如上述器官明显，约为心脏组织表达水平的60%。

3 讨 论

小尾寒羊是我国特有的地方绵羊品种，具有高繁殖率、耐粗饲的优良特性，但其产肉、产毛性能低下，毛多以粗毛和两型毛为主，尽管经过一定的选育提高，但仍主要用于毛毡、毛毯等生产为主，无法用于高档毛纺面料[18]。新吉细毛羊是本世纪初我国新疆和吉林两省育种学家以澳洲美利奴羊毛为父本，以地方细毛羊为母本培育出的细毛羊品种，具有毛用性状优良、遗传潜力大等突出优点[19]。小尾寒羊与新吉细毛羊同时可作为绵羊毛品质遗传机制研究的理想动物模型，用以挖掘影响毛用性状的功能基因。实验室前期研究发现小尾寒羊皮肤毛囊组织结构存在显著差异，差异之一为毛细血管密度差异，进一步分析发现VEGF 家族基因在绵羊皮肤中均有表达，且存在类型多样的可变剪切突变体。鉴于皮肤组织脉管结构分布丰富，毛囊生长发育与周期过程中同样伴随着周围毛细血管的新生与退化过程[20]，VEGF 可能作为重要的血管增殖调控因子直接参与毛囊周围血管新生与退化，间接调控毛囊及毛发生长发育过程[21]。本文克隆出绵羊VEGF-B基因mRNA 并对其进行了系统的生物学分析，为进一步研究绵羊VEGF-B基因功能奠定基础。

目前基因数据库中尚未有绵羊VEGF-B基因mRNA序列信息的报道，本实验利用预测序列设计引物在小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织扩增长短不同的2 条片段VEGF-B基因mRNA 序列，分别与预测序列XM_0121 17071.2 和XM_012117072.2 相同，但并未发现与另一种类型突变体所对应的片段（序列：XM_012117073.2），提示VEGF-B基因在绵羊皮肤组织中表达具有自身特点。值得注意的是mRNA 中间部分缺失导致所编码蛋白产生移码突变，这种类似突变在不同物种间普遍存在[17]，其原因在于这种突变类型并未改变PDGF 功能结构域，PDGF 功能结构域是VEGF 家族的功能核心，其左右两端序列会在蛋白加工成熟过程中由蛋白酶水解去除[22]。2 种类型VEGF-B 蛋白C 端蛋白酶切位点预测结果证实存在蛋白酶类型及数量差异，进而可能影响VEGF-B 的加工过程及功能活性。

为探寻VEGF-B不同类型可变剪切体组织器官的表达特性，对10 个组织器官检测发现VEGF-B不同类型可变剪切体具有组成型表达的特性，但也可能存在组织器官间的细微差别，该基因与传统可变剪切具有组织器官特异性的特点存在一定差异[23-24]，说明2 种类型可变剪切体具有普遍性，也提示氨基酸序列突变及潜在蛋白酶解加工过程同样具有普遍意义。实验室研究结果表明，在皮肤组织中除VEGF-D基因不存在可变剪切突变体外，VEGF-C[25]、B、A[13]和PGF[15]均存在不同类型的可变剪切突变体，进一步证明VEGF 基因的复杂性[26]。

对不同组织器官VEGF-BmRNA 表达检测结果显示，在肺脏和卵巢组织较心脏呈现高表达，脾脏和肾脏基本持平，肝脏、肠道、肌肉和脑组织较心脏下调表达，该结果与人VEGF-B表达模式部分相似[5,27]，似乎与组织器官血管密度不存在直接相关性。但考虑到VEGF-B功能主要参与血管内皮细胞增殖、血管通透性增强、细胞外基质改变及诱导新生血管生成等，可能在成年绵羊个体中VEGF-B 主要功能是维持血管通透性，如肺脏组织，而在发育完全且血管不太可能增生的组织器官如肌肉、脑等，其表达量维持较低的水平。但由于未对特定可变剪切类型进行进一步表达分析，不同类型是否在特定组织器官表现累积特性尚不得而知，这也是下一步研究的重点。

皮肤组织结构与功能复杂，既为机体与外界环境的第一道屏障，担负机体免受外界物理、化学及生物损伤等重要功能，同时也是指甲、毛发等皮肤附属物的发生组织。本实验室证实小尾寒羊与新吉细毛羊在皮肤组织结构及毛用性状相关指标存在显著差异。人皮肤组织中同样表达VEGF 家族基因，但在皮肤角质细胞和成纤维细胞中，对生长因子刺激，VEGF-B基因仅仅在皮肤成纤维细胞中呈现出上调表达，提示VEGF 家族更多参与皮肤组织修复等生理病理过程[28]，该结果与上皮细胞特异性转VEGF-B基因小鼠实验结果相似[10]。有研究表明，生长期毛囊中VEGFmRNA 表达上调[11]，转VEGF 基因亦能诱导毛囊周围血管的形成[29]，VEGF 促毛囊生长作用多指VEGF-A[30]，目前尚无其他家族成员与毛囊生长发育的相关研究报道，VEGF-B在皮肤组织表达分布及具体生物学功能值得关注。

4 结 论

本研究通过RT-PCR 方法从不同品种绵羊皮肤组织中成功地克隆出VEGF-B基因片段，序列分析发现VEGF-B片段由不同可变剪切方式生成并导致RNA 所编码蛋白序列移码突变，所编码的VEGF-B突变体具有物种间保守型。主要引起VEGF-B 突变体PDGF 结构域C 端蛋白酶切位点的改变。表达分析显示2 种类型VEGF-B突变体具有组成型表达特性，相对心脏组织、肺脏和卵巢组织呈现高表达，肝脏、肠道和脑组织中低表达。本实验为研究VEGF-B基因功能提供基础。