王越，李雅凝，曲晓磊，王旭彤

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

0 引言

丝状真菌(Filamentous fungi)是一种广泛分布于土壤、水域、空气及动植物体内外等自然环境中的真核微生物，在人类的生产、生活及基础生物学研究中具有重要地位和作用。在发酵、纺织、食品和皮革等工业中，丝状真菌可以提高产品品质降低污染风险。如黑曲霉(Aspergillusniger)能分解饲料中的大分子糖类为单糖和寡糖，并生成多种有机酸、维生素、生物酶、生长因子，有效提高了发酵饲料的营养水平和消化吸收率。还能产生抗生素物质激发动物机体自身有益菌种的繁殖增殖，抵制有害菌群生长；在农业上，丝状真菌具有生物防治的功能，如木霉菌(Trichodermaspp.)对多种植物病原菌有拮抗作用，往往通过竞争作用、抗生作用、重寄生作用和诱导宿主抗性等方式抑制目标病原体生长繁殖[1]；在医药卫生方面，丝状真菌同样具有重要作用，如桑黄(Sanghuangporusbaumii)作为一种珍贵的丝状真菌，其含有的多糖、黄酮及萜类物质具有重要的药用价值，作为主要活性物质的桑黄多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节及降血糖等多种生物活性，它可以通过提高机体免疫力而抑制肿瘤细胞的生长和转移，还能诱发肿瘤细胞的凋亡[2]。

由于丝状真菌的遗传背景复杂、育种周期长以及定向性较差，传统的育种方法(自然选择、杂交育种)已不能满足人们对新菌株的需求。随着基因时代的发展，大量丝状真菌基因组序列公布，丝状真菌的遗传背景逐渐清晰，其中丝状真菌基因功能的研究渐渐成为了热点。通过基因工程的手段在分子水平上研究丝状真菌的基因功能以及定向改良菌种的研究报道越来越多，而构建稳定高效的遗传转化体系是研究基因功能和定向改造菌株的基础。

目前关于丝状真菌遗传转化的研究报道较多，转化方法也具有多样性，对于转化后的丝状真菌筛选方法也多种多样。因此，综述了近年来丝状真菌遗传转化方法和阳性转化子的筛选方法，为进一步研究并应用高效遗传转化体系提供有益参考。

1 遗传转化方法及转化子检测方法的发展与应用

1.1 遗传转化方法

遗传转化是指宿主的感受态细胞吸收了同源或外源的大分子(质粒和染色体DNA)而在遗传性状上发生定向改变。在丝状真菌的转化中，可以以菌丝体、孢子、原生质体等为受体材料，将目的基因导入宿主细胞内，使其在宿主细胞中得到稳定整合、表达并遗传。

1.1.1 电击转化法。电击转化法是通过高压脉冲对丝状真菌的原生质体或细胞进行处理，使受体表面产生一个20～40 nm的电穿孔，从而使外源大分子(DNA)进入细胞内。电击法对受体细胞产生的扰动很小，保持了受体细胞的生理活性[3]。虽然电击法需要较昂贵的专业设备，但电击转化法转化效率高、操作简便，在许多实验中广泛应用。电击法多以原生质体为受体材料，已成功获得了草菇(Volvariellavolvacea)[4]、金针菇(Flammulinavelutipes)[5]、紫孢侧耳(Pleurotussapidus)[6]灵芝(Ganodermalucidum)[7]等丝状真菌的阳性转化子。由于目前丝状真菌的转化受体多为原生质体，而对于有些真菌来说，其原生质体制备过程繁杂，再生较难，转化效率较低，转化子不稳定，不适合进行原生质体转化[8]，因此电击法在丝状真菌中的应用具有一定局限性。

1.1.2 聚乙二醇(PEG)介导法。高国楠首创的聚乙二醇介导法是使用较早较普遍细胞融合方法，PEG是一种带有大量负电荷的细胞融合剂，在高pH条件下，碳酸钙可与DNA结合构成DNA-碳酸钙复合物，PEG通过干扰细胞膜表面的电荷平衡，影响细胞间的识别，从而促进外源DNA分子进入原生质体以及细胞间融合。2004年，王强等[9]首次通过PEG转化缓冲液将外源基因转入灵芝(Ganodermalucidum)，并在含有100 μg/mL潮霉素的培养基上进行筛选，筛选到的转化子通过PCR和Southern 杂交技术检测转化效率约为5～6个/μg (抗性转化子/pAN7-1+107个原生质体)。目前，PEG介导法已成功构建了灵芝(Ganodermalucidum)、黄曲霉(Aspergillusflavus)[10]、产黄青霉(Pennicilliumchrysogenum)[11]、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)[12]等丝状真菌的遗传转化体系。PEG介导法的转化效率受PEG聚合度、PEG浓度和作用时间、离子种类和浓度、融合剂pH、温度等很多因素影响。2016年，汪琪[13]等人从原生质体浓度、PEG浓度、PEG种类、转化介质Ca2+等6个方面对PEG介导的茯苓的转化体系进行探究，得到了最优的条件。相比于电击法而言，PEG介导法不需要特别的仪器设备，成本较低，操作简便。但PEG对在原生质体有一定的毒性，变异率高[14]，且由于受外部内部多种因素的影响，稳定性、重复性较差[13]，转化率较低，因此还有待于完善。

1.1.3 基因枪介导法。基因枪介导法，又叫生物弹道技术或粒子轰击细胞法，是利用基因枪将含有目的基因的DNA溶液打入细胞，使其穿过层层细胞结构导入目的细胞核内，完成基因转移。基因枪介导法转化的受体材料较为广泛，在动物、植物、叶绿体及丝状真菌的遗传转化中均有广泛应用。基因枪转化丝状真菌时可以以菌丝、孢子为受体材料进行转化，无需制备原生质体，操作简单。2005年，郭丽琼[15]等人首次建立了草菇(Volvariellavolvacea)基因枪法遗传转化体系，以草菇的菌丝体为材料，获得了8个阳性转化子。2006年，王阳[16]等人应用基因枪法以小麦条锈菌 (Pucciniastriiformisf.sp.tritici)的夏孢子为受体材料进行了转化，为深入研究小麦条锈菌的毒性基因及其结构的变异奠定基础。基因枪法具有受体材料广泛、操作简单等优点，但是基因枪介导法需要专门的实验仪器，耗材也很昂贵，成本较高，多拷贝整合还可能发生共抑制[17]，转化率相对较低。

1.1.4 限制性酶介导的整合法。限制性内切酶介导的整合法(REMI)是指在线性的质粒和相应的限制性内切酶的作用下转化丝状真菌的原生质体[18]，限制性内切酶进入受体细胞后，识别受体DNA上特异的位点并进行切割，产生的粘性末端可以质粒互补相连，质粒DNA 通过碱基配对插入受体细胞的基因组，从而成功实现转化。限制性内切酶介导的转化技术具有定向性强、转化效率高、适用范围广等特点。2007年，周庆新[19]利用限制性内切酶介导的整合技术转化尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)，最后获得了20株尖孢镰刀菌转化子，而没有得到嗜热丝孢菌的转化子。由于影响REMI转化的因素有很多，如原生质体的制备、质粒和限制性内切酶的选择都会影响转化率，作者分析试验选用的质粒pUCATP携带的A.nidulans的PtrpC启动子不能在嗜热菌中起作用从而无法调控潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)基因表达。2010年，江蓓蓓[20]等以玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularialunata)WD-1的原生质体为实验材料，将含有HPT的质粒pUCATPH进行限制酶介导的整合转化，成功获得了阳性转化子，并在培养基上培养发现转化子的产孢量和生长速度明显慢于野生菌株，这为玉米弯孢霉叶斑病菌的防治提供了有意义的线索。酶介导法虽然定向性强，范围广，但是酶的种类和浓度对转化效率影响很大，这大大限制了酶介导方法的使用。

1.1.5 根癌农杆菌介导法。根癌农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，在自然界中，农杆菌通过侵染受体伤口进入细胞后，Ti质粒上的Vir基因区域和T-DNA区域共同作用，将T-DNA高效率地整合到宿主的基因组上并进行表达。因此，人们选择将外源目的基因插入到质粒的T-DNA区域，通过农杆菌的感染将外源基因整合到宿主细胞的染色体上，培养得到转化子。根癌农杆菌介导的遗传转化法(ATMT)最初是由 Bundock[21]在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中开始应用的，随后该方法被用于进行多种丝状真菌的研究。1998年de Groo[22]利用根癌农杆菌，以原生质体、分生孢子和菌丝体为受体材料成功转化了多个丝状真菌，黑曲霉(Aspergillusniger)、云孢镰刀菌(Fusariumvenenatum)、瑞士木霉(Trichodermareesei)、黑木耳炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、双孢蘑菇(Agaricusbisporus)等。2000年，Chen等[23]首次以双孢蘑菇(Agaricusbisporus)的菌褶组织为受体材料，利用农杆菌介导转化法实现了双孢蘑菇的遗传转化。目前在食用菌中已有很多物种进行了遗传转化体系的构建，比如双孢蘑菇(Agaricusbisporus)、金针菇(Flammulinavelutipes)、草菇(Volvariellavolvacea)等[24]。相对于其他的丝状真菌遗传转化方法，农杆菌介导的丝状真菌的转化具有操作简便、受体广泛、转化效率高、单拷贝插入和遗传稳定等优势[25]。但根癌农杆菌介导的转化受很多因素影响，如选用的根癌农杆菌菌株类型、受体材料、二者共培养的时间和浓度以及筛选转化子需要的抗生素的种类等。其次，根癌农杆菌介导法对载体要求较高，携带T-DNA的双元表达载体的构建过程较为复杂[26]，同时研究发现T-DNA的插入具有偏好性，而且可能打断宿主原有的基因或引起染色体重排，从而改变了宿主的表型。2013年，俞咪娜[27]等人在对稻曲病菌突变体5062的研究中发现突变体菌与野生菌的表型有显著差异，而且T-DNA插入引起了稻曲病菌的染色体重排现象，从而推测突变体5062的表型发生变化是T-DNA插入和染色体重排共同作用的结果。

1.2 丝状真菌转化子的检测技术

丝状真菌的遗传转化系统的建立通常以载体为基础，将改造的载体通过各种转化方法转入受体细胞内，从而使载体上的目的基因在宿主细胞中进行扩增和表达。由于目前遗传转化的效率较低，在转化过程中，不是所有的宿主细胞都一定被转化，也不是所有的转化细胞中一定含有目的基因。因此，在丝状真菌进行基因转化后，外源基因是否进入丝状真菌细胞，并整合到染色体上，整合的外源基因是否能够稳定表达是研究丝状真菌遗传转化系统的重中之重。所以准确快速鉴定转化子对丝状真菌遗传转化体系构建具有重要的意义。

1.2.1 以基因为基础的检测技术

1.2.1.1 PCR鉴定：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是1985年创立的一种在体外模仿DNA的天然复制的分子生物学技术，具有周期短、操作简便、灵敏度高、特异性强的特点，在遗传转化子的鉴定中应用广泛。在丝状真菌转化子检测中，我们通常以转化子的单个克隆为模板，利用特异性引物或通用引物对转化子中的目的基因进行PCR扩增，从而鉴定和筛选阳性转化子。目前常用的检测基因有GUS基因，GFP基因，HPT基因等。但由于PCR扩增有时得到的产物特异性较差，会出现假阳性扩增，因而对转化子的阳性检测还需要其他方法进一步鉴定。

1.2.1.2 Southern 印迹杂交鉴定：Southern印迹杂交是1975年英国人Southern发明的一种研究DNA图谱的基本技术，利用电泳分离的待检测的靶单链DNA与标记的单链核酸探针进行杂交，从而判断待检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。2006年，应盛华等[28]对球孢白僵菌(Beauveriabassiana)孢壁蛋白相关的耐热分子机理进行了研究，并且建立了基于球孢白僵菌芽生孢子的新型遗传转化体系。应盛华等人挑选了10个转化子进行Southern杂交鉴定，有2个转化子显示出杂交带。2012年，师亮等[29]首次建立了根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化系统，提取了转化子的DNA进行了Southern blot检测，转化子均显示阳性杂交信号。Southern杂交技术能够防止操作污染和质粒转化残留所引起的假阳性的信号出现[30]，具有特异性强，灵敏性高的特点，是检测外源基因导入的重要手段。随着Southern杂交技术的不断发展，逐渐成熟，其越来越多地被应用到丝状真菌基因工程基础研究中。

1.2.1.3 Northern 印记杂交鉴定：Northern 印记杂交鉴定是指将提取的转化子的总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离后，转移到固相支持物上，用探针与膜杂交，然后通过探针的标记性质来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。2006年，于寒颖等[31]为了对核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)arom基因进行功能验证和相应蛋白的研究，构建了酵母表达载体pYES2-arom并将其导入酿酒酵母H158 (SaccharomycescerevisiaeH158) 中，对转化子进行Northern杂交结果显示，核盘菌arom基因在酿酒酵母胞内成功表达。Northern印迹杂交技术是一种快速检测和筛选阳性克隆片段的方法，并具有简便、经济的优点，在动物和植物转基因检测方面应用广泛。随着分子生物学技术的发展，对Northern blot技术优化的相关研究也越来越多。在Northern blot中最为常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，但甲醛具有较强的毒性，2004年，胡盛平[32]等通过改良，建立了安全无毒RNA凝胶电泳法，其次他们还简化了RNA的转印过程。此外，Northern blot需要提取RNA，但由于RNA极易受外界环境因素特别是核糖核酸酶的影响，其次在丝状真菌中，由于复杂的细胞壁和内源酶活性以及干扰RNA提取的多糖等物质的存在，从丝状真菌中提取和纯化出有生物活性的RNA比较困难。因此Northern杂交在丝状真菌的转化子鉴定中应用较少。

1.2.1.4 转化子DNA测序：DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，即检测腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶与胸腺嘧啶的排列方式。由于DNA测序技术的不断发展，为了更准确的鉴定转化子为目的克隆，我们通常会利用PCR、核酸杂交技术鉴定之后，从阳性克隆中挑选几例转化子进行DNA测序，以便再次确认是否转化成功。2015年，丑天胜等[33]通过高通量测序技术对金针菇(Flammulinavelutipes)的一个RNAi转化子菌株1382R3进行了DNA测序，成功检测到了外源载体DNA在基因组中的插入位点和拷贝数量。2017年，崔月贞[34]等采用PEG诱导原生质体转化的方法，将绿色荧光蛋白基因(GFP)转化到球炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)中，转化子经测序表明GFP基因已整合至球炭疽菌基因组DNA中。DNA测序技术的迅速发展，以高通量、低成本为特点的二代测序技术得到了充分的发展与应用，是一种科学、可靠的方法，但是对转化子逐一测序，所需的工作量大，费用比较高。2020年，刘媛媛[35]等应用矩阵设计对金针菇的转化子进行测序，大大节省了测序费用、提高效率，并且准确检测出其插入位点和拷贝数。

1.2.2 以蛋白质为基础的检测技术

1.2.2.1 营养缺陷型筛选：营养缺陷型菌株与野生型菌株相比失去了合成某些代谢物如氨基酸、维生素的能力，只能在完全培养基或补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长。在构建丝状真菌遗传转化体系的过程中，只有转化子可以在不含该种成长因子的培养基中生长。营养缺陷型标记基因来自宿主本身，有利于基因表达，易于筛选，在大多数丝状真菌的遗传转化中应用广泛。1973年，Mishra等首次利用肌醇缺陷型粗糙脉孢菌(Neurospora)进行转化实验[36]。目前，营养缺陷型筛选标记在酵母菌、丝状真菌以及少数细菌中已经得到应用。1979年, Botstein[37]和Struhl[38]以编码乳清苷5-磷酸脱羧酶的基因(ura3)作为选择标记构建酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)转化系统。这类筛选标记在构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等科学研究模式菌， 以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(pichiapastoris)等基因高效表达体系应用最为成功。在丝状真菌的遗传转化中，尿嘧啶营养缺陷型是一种常用的营养缺陷型标记。2019年，周陈力[39]等人采用紫外光诱变、单单杂交、孢子单核化的方法从灵芝单核体菌株出发，成功得到尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株，为灵芝遗传转化体系的构建提供了材料。营养缺陷型菌株在科学研究领域有重要作用，但部分丝状真菌营养缺陷型菌株不易获得，给营养缺陷型的筛选带来麻烦。

1.2.2.2 抗性基因筛选：抗性基因筛选是指在构建丝状真菌遗传转化体系时，常常选择带有抗生素抗性基因的载体转入受体菌株，而后在含有该抗生素的培养基上帮助筛选出已转化的细胞。相比于营养缺陷型筛选，抗性基因筛选对受体菌没有特定的要求，操作起来比较简单方便。但由于不同菌株对不同种类和浓度抗生素的敏感性不同，因此，筛选出合适的抗生素浓度种类和浓度对转化子的鉴定具有重要意义。目前，被广泛应用的抗生素类标记基因包括氨苄青霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，链霉素抗性基因，四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，潮霉素抗性基因等。其中，以HPT作为筛选基因的研究最为广泛。2010年，董晓雅等[40]在利用PEG-CaCl2介导原生质体转化的方法构建平菇(Pleurotusostreatus)遗传转化体系的研究中，将含有HPT的载体转入平菇，转化子经过80 μg/mL潮霉素初筛和100 μg/mL潮霉素复筛，获得了具有潮霉素抗性的阳性转化子。2017年，张昕[41]等在研究金针菇免疫调节蛋白基因(FIP-fve)对金针菇本身的生物学功能时，构建了带有HPT的FIP-fve基因沉默载体，并利用农杆菌介导法将其转入金针菇菌丝，将转化后的金针菇菌丝块置于含有潮霉素(9 μg/mL)的培养基上培养，共得到5个金针菇阳性转化子。使用药物抗性相比于营养缺陷型标记更简单，不需要受体具有营养缺陷型，因此抗性基因筛选在丝状真菌的转化中应用更加广泛。但使用药物筛选易导致菌株产生耐药性，抗性较为不稳定，只能在初筛和复筛中应用，对于抗性筛选出的转化子，仍需要应用其他检测方式鉴定基因是否整合到真菌基因组中。

1.2.2.3 报告基因检测：报告基因是一类用于检测组装的嵌合基因在导入受体细胞后是否具有功能的指示基因，通常把目的基因与报告基因组装成嵌合基因，通过检测它的表达产物来判断外源目的基因是否成功整合进宿主细胞。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：①表达产物具有相对的稳定性，很容易被检测；②表达产物在受体细胞中本不存在，或仅存微量的相似的内源性表达产物；③报告基因的表达对受体细胞无影响。最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、荧光素酶基因、荧光蛋白家族等。其中CAT是真核基因表达调控中最早使用的报告基因之一[42]，但由于其具有放射性，与其他报告基因相比线性范围较窄，灵敏性较差；荧光素酶基因虽然操作简单、灵敏度高，但是其所需要的检测仪器较贵；荧光蛋白家族包括绿色、红色、黄荧光蛋白等，其中绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的一种。2008年，王晓利等[43]建立农杆菌介导的瑞士木霉(Trichodermareesei)转化体系中GFP作为标记基因，通过荧光显微镜下对转化子进行荧光观察，结果显示在瑞氏木霉菌丝和孢子中都可以观察到强烈的绿色荧光。2016年，祁浩等[44]利用GFP基因验证了所构建的绿色荧光蛋白酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达载体具有便捷筛选及良好的表达效果。GFP基因在丝状真菌的研究中广泛应用，是一种良好的标记物，其表达对寄主细胞无毒性作用，并且易于检测，只需要紫外光或蓝光激发，就可观察到绿色荧光。除GFP基因之外，GUS基因存在于一些细菌基因组内，在真菌中很少或完全检测不出GUS活性，而且GUS报告基因的检测仅需简单的化学反应即可肉眼观察到，因此GUS基因在分子生物学研究中使用频率更高。2012年，徐志超等[45]用香菇三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子构建了载体p1305.1-GPD，以GUS基因为报告基因，通过根癌农杆菌介导将载体转入灵芝(Ganodermalucidum)细胞内，转化子在GUS染色后呈现明显蓝色，表明GUS可以作为筛选灵芝转化子的报告基因。2012年，师亮[29]等在灵芝(Ganodermalucidum)中分别构建了EGFP和GUS报告基因表达载体， 通过对转化子的检测表明GUS在灵芝中更加敏感。目前利用报告基因来检测转化子已经是一种广泛应用的手段，但是报告蛋白的半衰期较长，影响了基因表达的实时监测，以及报告基因的灵敏度、检测方法的容易程度、检测所需的费用等仍是我们应该考虑的问题[42]。

1.2.3 生物学鉴定。除了利用分子生物学技术从基因层面进行转化子的鉴定之外，转化子和野生型菌株在一些生物学特性方面也有明显差异。2010年，董晓雅[40]等在构建平菇(Pleurotusostreatus)遗传转化体系时，首先利用潮霉素对转化子进行初筛和复筛，发现阳性转化子菌丝较为浓密，生长速度快，而假阳性转化子菌丝则相对稀疏，生长速度慢。2016年，柏英等[46]在研究通过农杆菌介导的同源重组的方法构建的黑曲霉(Aspergillusniger)ras基因敲除子时，从生长速度、菌丝形态及产孢情况、生长温度、生物量等生物学特性方面对敲除子进行了研究。研究发现，转化子的生长速度比野生型慢，而且菌丝致密、颜色较深同时转化子边长菌丝边产孢。2017年，孙佳莹[47]等以根癌农杆菌介导法构建了玉米北方炭疽病菌(Aureobsidiumzeae)的遗传转化体系，通过该体系获得了5种转化子，并将野生型的菌落特征和5种转化子一并进行了比较，结果发现转化子在菌落颜色、生长速度、革质化及产孢量等方面都有一定变化。2019年，宋燕娇[48]等在采用PEG介导的原生质体转化法阴环炭团菌(Annulohypoxylonstygium)TJAS01的糖转运蛋白编码基因TJAS01-V10012900进行敲除的研究中，发现转化子在生长速度、菌落形态特征方面与野生型菌株相比具有明显差异。通过形态学观察、生物量测定的等生物学鉴定来筛选转化子更加直观，操作简单，可以作为分子生物学鉴定手段的辅助手段加以利用。

2 总结和展望

丝状真菌作为一种在工业、农业、医药卫生领域具有广泛应用前景的微生物，对其基因功能的研究尤为重要。近年来发展了许多真菌基因功能研究方法，如转座子标签技术、基因敲除技术、基因过表达技术等，这些技术的研究主要以真菌的遗传转化为基础。目前丝状真菌的遗传转化主要存在以下几个方面的问题，转化率低、筛选鉴定不够快速准确、操作较为复杂。

2.1 转化率低

丝状真菌的遗传转化效率与所选用的转化方法、受体材料以及质粒载体的选择密切相关。如PEG介导法、电击法或限制性内切酶法多以原生质体作为受体材料，因此原生质体的再生是影响转化率的一个重要因素。原生质体再生率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、酶解温度、预处理等的影响，提高原生质体的再生率是提高转化率的关键因素。对于部分丝状真菌而言，原生质体制备过程繁杂，再生较难，我们可以尝试以菌丝体、孢子为受体材料进行转化。根癌农杆菌介导的转化可以不制备原生质体，操作简便，转化效率相对较高，是丝状真菌遗传转化中较为常用的方法。但在根癌农杆菌介导的转化中，农杆菌菌株的类型、乙酰丁香酮的浓度、共培养的条件等也对转化效率有影响。此外，外源基因在受体菌中表达还与所选用的载体有关，不同的载体类型以及驱动外源基因表达的启动子对转化效率也有较大的影响。2012年，师亮[29]构建灵芝的遗传转化体系时发现，内源启动子能够显著提高转化效率。

2.2 筛选鉴定不够快速准确

在多种丝状真菌的转化子鉴定方法中，抗生素筛选是最直观的筛选转化子方法，但是假阳性率较高；PCR鉴定检测速度快、成本较低，但是在转化子中也会存在一定的假阳性；Southern杂交操作较为复杂、成本较高，但是特异性强、灵敏度高。因此在遗传转化研究中，常常将3种方法结合鉴定阳性转化子可以节约试验时间、降低试验成本，并且检测更灵敏。此外，荧光蛋白基因作为筛选标记具有荧光稳定、易于检测、对细胞无毒害、无物种特异性和无需底物等特点，也经常与PCR鉴定相结合，但由于一些真菌菌丝自身带有荧光，所以不适用于所有丝状真菌。因此针对不同的真菌综合选用合适的筛选方法对阳性转化子的筛选具有重要意义。

2.3 操作较为复杂

我们现有的转化方法有些需要特定的设备才能进行，如基因枪介导法。其他的几种转化方法也需要筛选出合适的转化条件。另外原生质体的制备也是一个比较复杂的过程，因此，改良丝状真菌原生质体制备和再生的手段，或者尝试以孢子或其他受体材料进行转化，可能会使转化更加简单高效。

丝状真菌作为一种具有较高经济价值的菌类，遗传研究开展得较晚，相信随着分子生物学手段的不断改进和创新，丝状真菌的遗传转化体系的建立将越来越精确、高效。进一步加深对现有转化方法的研究，如T-DNA在丝状真菌中的插入和整合机制，或综合多种转化方法共同进行转化，这对构建丝状真菌转化体系，研究其基因功能以及丝状真菌的改造具有重要的意义。