唐涛涛，李江，2，杨钊，向福亮，王跃虎，李彦澄

（1贵州大学资源与环境工程学院，贵州贵阳550025；2贵州大学环境工程规划设计研究所，贵州贵阳550025）

污泥作为污水处理厂的主要副产物，其产量在2017 年已达4.328×107t（含水率80%计）[1]。如何实现污泥的处理处置是当前污水处理厂面临的一大难题。目前，有多种技术可对污泥进行资源化利用，如燃烧、热解和厌氧消化[2]。但污泥在厌氧消化过程中仅有40%～50%的有机物质会转化为甲烷，这不仅使污泥的厌氧消化效率较低，还会影响产气量[3]。因为污泥中的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）会把微生物细胞聚合成网状物，使得EPS和微生物分别以物理、化学阻挡层的方式限制污泥的水解速率[4]。从而使得污泥厌氧消化反应器具有水力停留时间（hydraulic retention time，HRT）长（20～50 天）和占地面积大等缺点[4-5]。在厌氧消化过程中，营养物质、pH、温度、C/N及微生物群落结构等因素均会对厌氧消化效率产生影响。其中，营养物质与微生物群落结构对提高消化效率起重要作用[6]。

近年来，随着分子生物技术的不断完善和发展，使得人们对厌氧体系中微生物的功能解析成为可能。本文综述了污泥在厌氧消化过程中常见的微生物群落，以及它们在厌氧体系中发挥的作用；并分析温度、营养物质、pH、氨氮（NH4+-N）等影响因素对厌氧微生物的影响，以期为提高厌氧消化效率提供参考借鉴。

1 常见的厌氧微生物群落分布

厌氧微生物目前尚无公认的准确定义，但通常认为厌氧微生物是只能在低氧分压条件下生长，而不能在空气中（18%氧气）和（或）在10%二氧化碳下的固体培养基表面生长的一类微生物的总称[7]。

1.1 细菌

污泥在厌氧消化过程中主要涉及水解酸化细菌和产甲烷古菌。其中，水解酸化细菌在污泥厌氧消化过程中发挥重要作用。因为水解细菌能将污泥中的碳水化合物、蛋白质和脂质转化为简单的溶解性单体物质，而酸化细菌能将水解产物进一步转化为酸性产物（挥发性脂肪酸），从而为微生物的生长提供碳源。显然，细菌不仅对污泥中有机物的水解和酸化起关键作用，而且还会影响厌氧消化的效率。以往的研究发现，古菌在厌氧体系中约占微生物总量的10%[8]。可见，细菌在微生物总量中所占比例高于古菌，所以细菌群落结构的变化会影响古菌群落[9-10]。根据Ahring[11]的报道，厌氧微生物至少涵盖了20 个门的细菌， 包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、螺旋体门（Spirochaetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）等。在上述菌群中，Bacteroidetes和Firmicutes是水解过程中主要的菌群；Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes是酸化过程中主要的菌群[12]。 可 见 ，Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes群落的变化会对厌氧消化体系产生影响，这是因为它们是厌氧消化过程中的主要门分类[13-14]。

Bacteroidetes不仅是厌氧消化体系中的常见细菌类群，也是一种主要的产酸菌[15-16]。这是因为属于Bacteroidetes的细菌在有机物降解过程中会产生各种裂解酶[13]，所以Bacteroidetes对复杂碳化合物具有降解作用[17]，如纤维素和半纤维素。而以往的研究发现，Bacteroidetes可将纤维素转化为单糖(主要是葡萄糖)[18]及有机酸[19]，半纤维素转化为D-木聚糖和葡萄糖[20]。且Bacteroidetes将半纤维素转化为葡萄糖后会进一步对葡萄糖进行分解，这是因为Bacteroidetes是降解糖类的主要菌群[20]。因此，Bacteroidetes中大部分细菌能产生乙酸、丙酸、甲酸及丁二酸[21]，这也表明Bacteroidetes的分布与挥发性脂肪酸（VFAs）的浓度有关[21]。显然，厌氧消化过程中Bacteroidetes丰度的变化会导致体系中的VFAs 浓度发生变化，从而对体系的pH 产生影响。

Proteobacteria和Chloroflexi作为厌氧消化体系中主要的细菌类群，在厌氧消化中也发挥着重要的代谢功能作用。由于Proteobacteria的类型比较复杂，因此Proteobacteria在环境中可作为不同角色参与物质代谢，并作为微生物群落的重要组成部分参与群落演替过程[22]。 以往的研究发现，Proteobacteria中的许多菌群不仅能利用葡萄糖、丙酸盐、丁酸盐等小分子化合物[23]；而且Proteobacteria在酸化过程中会产生乙酸作为主要的酸化产物[14]。同时，近年的研究也发现，当环境中存在有毒有害物质时会促进Proteobacteria的生长，如Luo 等[24]研究发现，当体系中存在菲时，Proteobacteria的丰度会从9.3%增加到13.0%。可见，当环境中存在有毒有害物质时，Proteobacteria仍具有较高的生存能力。Chloroflexi作为一种在污泥厌氧消化过程中常见的菌群不仅丰度较高，而且对单糖和多糖均具有降解能力，并产生乙酸[13]。同时，Chloroflexi对有机负荷具有较高的承受能力[25]。

在厌氧环境下，Firmicutes分布较广，包含众多重要的功能微生物，如梭菌纲、芽孢杆菌纲等[26]。在厌氧消化过程中，Firmicutes对有机物的水解和酸化具有重要作用[27]，这是因为Firmicutes能产生胞外酶，如纤维素酶、脂酶、蛋白酶及其他胞外酶，而这些酶在纤维素、蛋白质、半纤维素、脂质、糖类及氨基酸等有机物的分解代谢中扮演重要作用[28]，从而实现有机物的降解；且Firmicutes还能利用乙酸[29]。Lim 等[30]研究也发现，在厌氧消化过程中，细菌群落会由Proteobacteria转变为Firmicutes。在众多Firmicutes中的菌落中，梭菌属（Clostridium）是一类严格的厌氧菌，在降解碳水化合物的同时会产生乙酸、丁酸等产物[31]。可见，Clostridium丰度的变化会对厌氧消化系统的pH 产生影响。而以往的研究也发现，Clostridium丰度的增加与pH的增加有关[32]。此外，Clostridium也能与氢型产甲烷菌互相作用以实现有机酸的降解[33]。与Clostridium相似，芽孢杆菌（Clostridia）在厌氧条件下也能利用溶解性有机物产生VFAs[34]。但Clostridia不仅能有效降解结构复杂的有机物，而且还能使乳酸或乙酸发酵为氢气（H2）和二氧化碳（CO2）[8,14,35]，为氢型产甲烷菌的生长提供能源。

除Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes外，厌氧消化体系中还存在部分丰度较低的门，如Cloacimonetes、Spirochaetes、酸杆菌门（Acidobacteria） 和 放 线 菌 门（Actinobacteria）、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Ignavibacterium等菌群。其中，Cloacimonetes对有机物具有水解和酸化能力[36]；Acidobacteria在厌氧条件下可将纤维素降解并产生乙酸[37]；Actinobacteria中的部分菌属会产生丙酸[14]；而Spirochaetes能将碳水化合物或氨基酸转化为乙酸、氢气（H2）和二氧化碳（CO2）等[38]。此外，有研究也指出Spirochaetes、Planctomycetes、Lentisphaerae、Deferribacteres和Verrucomicrobia等菌落对有毒有害物质具有一定的促进作用，如多环芳烃（PAHs）、二氯甲烷、原油中污染物和含氯乙烯[39-40]。同时，嗜温化学异养的细菌Ignavibacteriumsp.可以提高厌氧污泥的降解性能，是推动厌氧降解的主要参与者[41-42]。

1.2 古菌

在厌氧消化过程中，水解和酸化阶段均有细菌参与，而产甲烷阶段完全由古菌参与。产甲烷代谢途径的本质是产甲烷菌利用细胞内一系列特殊的酶和辅酶将CO2或甲基化合物中的甲基通过一系列的生物化学反应还原成甲烷[43]。产甲烷菌根据产甲烷途径主要分为三种类型，即乙酸型、氢型和甲基型产甲烷菌。其中，大多数的甲烷主要是通过乙酸型和氢型产甲烷菌作用所产生[44]。以往的研究发现，甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、甲烷丝菌属（Methanosaeta）和Methanomicrobium是主要的产甲烷微生物[45-47]。除上述菌属外，在厌氧反应器中还会检出Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae、甲 烷 嗜热杆菌属（Methanothermobacter）、甲烷螺菌属（Methanospirllum）、Methanoculleus和Methanomassilliicoccus。其中，Methanosarcina和Methanosaeta均属于乙酸型产甲烷菌。Methanosarcina属于多功能的产甲烷菌，即具有乙酸型产甲烷菌的能力，又具有氢型和甲基型产甲烷菌的能力；故Methanosarcina能利用乙酸、甲醇、甲胺、二甲胺和H2/CO2产生甲烷[48]；且Methanosarcina也是唯一一种能通过上述三种途径产生甲烷的菌种[49]。同时，Methanosarcina对挥发性脂肪酸（VFAs）和有机承载率（OLR）具有较高的承受能力[50]。在厌氧环境下，随着乙酸浓度的变化会使得Methanosarcina和Methanosaeta丰度发生变化。以往的研究表明，高浓度的乙酸环境适于Methanosarcina生长， 而低浓度乙酸适于Methanosaeta生长[51-52]。近年的研究也发现，当乙酸浓度在250～500mg COD/L 时，Methanosarcina为主要菌种[48]。

除Methanosarcina和Methanosaeta属于乙酸型产甲烷菌外， 在已检出的产甲烷菌中，Methanothermobacter、Methanoculleus、Methanospirllum、Methanobacterium、Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae和Methanobrevibacter为 氢 型 产甲烷菌，主要利用H2/CO2或甲酸生成CH4气体[53-58]。而Methanomassiliicoccus为甲基型产甲烷菌，主要利用甲醇（或甲胺）与氢作为电子供体产生CH4气体[59-60]。可见，厌氧消化反应器中的优势古菌主要集中在乙酸型和氢型产甲烷菌，它们的共同特点是能够利用细菌的分解产物（乙酸、氢气等）产生甲烷。

2 微生物群落结构变化的影响因素

在不同条件下，微生物的群落结构存在较大的差异。其中，温度、营养物质、pH、氨氮(-N)及物质中含有的有毒有害物质等因素均会对厌氧消化过程中的微生物群落产生影响。

2.1 温度

目前，对厌氧消化的研究主要集中在中温（30～40℃）和高温（50～60℃）条件。与中温厌氧消化相比，高温厌氧消化具有一些优势，如具有较高的代谢速率、使病原体失去活性以及更高的产气量[61]。但在高温条件下进行厌氧消化会使得体系中的挥发性脂肪酸（VFAs）（尤其是丙酸）浓度较高，而中温厌氧消化则能够维持较高的有机负荷率（OLR）[62]。同时，由于VFAs的逐渐积累又会导致发酵细菌和产甲烷古菌的群落结构发生变化[63]，从而影响厌氧消化的进行。Guo 等[64]研究发现，温度对微生物群落多样性的影响明显强于OLR。当温度为35℃时，厌氧体系中的微生物多样性高于45℃和55℃时。Wu等[65]研究了餐厨垃圾在高温（55℃）厌氧消化启动阶段微生物群落的适应性，发现Firmicutes的相对丰度逐渐增加，而Proteobacteria和Thermotogae的相对丰度则降低，Methanosarcina菌群增加。同时，有研究也发现，温度的变化也会对产甲烷菌的生长产生影响。如Methanobrevibacter和Methanosarcina最适温度范围分别为37～39℃和35～40℃，而Methanothermobacter thermoautotrophicum（嗜热自养甲烷杆菌）为65～70℃。Methanobacterium和Methanosaeta种属在中温和高温条件下都能生长[66]。

2.2 营养物质

营养物质的差异对厌氧微生物群落结构的形成具有重要的影响。由于部分废弃物的碳氮比(C/N)较低不利于厌氧消化的进行，因此会向体系中添加营养物质提高消化性能。Tang等[67]研究发现，向污泥中添加不同类型秸秆会对污泥厌氧消化体系中的微生物产生影响。 其中，Bacteroidetes、Proteobacteria、Firmicutes、Chloroflexi、Cloacimonetes（细菌）和Bathyarchaeota（古菌）菌群的变化最为显著。无论何种类型秸秆的添加均会促进Bacteroidetes、Cloacimonetes和Bathyarchaeota的 生长，但秸秆类型的变化会对不同菌群产生不同的促进作用，如小麦秸秆对Bacteroidetes的促进能力较强，玉米秸秆对Cloacimonetes的促进能力较强，水稻秸秆对Bathyarchaeota的促进能力较强。与此同时，小麦秸秆对Proteobacteria的抑制作用较强，水稻秸秆对Firmicutes的抑制作用较强，玉米秸秆对Chloroflexi的抑制作用较强。李新[68]的研究也发现，向污泥中添加纤维素也会对微生物群落产生影响。其中，Aminicenantes的变化最为显著，并随着纤维素添加量的增加而减少。由此可见，营养物质类型的不同会对厌氧体系中的微生物群落结构产生影响。Mata-Alvarez等[69]通过对共消化的分析也发现，细菌群落结构容易受到原料比例的影响，而甲烷菌更易受到环境条件（如VFAs和氨氮浓度）的影响。

2.3 pH

厌氧微生物的生长、物质代谢与pH 有密切的联系，因此pH 的变化直接影响着厌氧消化的进程和产物，不同微生物对pH 的要求不同，过高或过低的pH 均会导致水解菌和产甲烷菌的活性产生变化，从而影响厌氧消化的稳定运行。在pH 迅速调至5.5 的酸化厌氧消化反应器中，细菌和古菌群落发生了显著演替。在开始的13 天内，产甲烷菌的数量从34%降至8%，71 天时降至2%～5%[70]。在酸化的反应器中，细菌的数量也会明显减少[71]。酸碱的急剧变化能引起厌氧消化反应器运行效率的显著下降，其内在原因是对酸碱耐受性差的微生物种群数量和活性受到抑制，相关的代谢功能出现衰退。Romsaiyud等[72]研究表明，水解菌的最适pH范围在5.3～8.3 之间，过低pH 会对水解菌产生离子毒性，从而影响水解酶的活性[73]。此外，产甲烷菌对pH 也极其敏感；以往的研究发现，产甲烷菌的最佳生长pH 应在6.5～8.2 之间[74]；若pH 低于该范围，会抑制产甲烷菌活性，当pH低于6.2时会对产甲烷菌产生毒害作用[75]。

2.4 氨氮（ - N）

2.5 有毒有害物质

2.6 搅拌

搅拌技术作为一种改善传质效果、解决物化及生化反应过程中物料混合效果不均匀等问题的手段，搅拌在厌氧消化过程中发挥着重要的作用[86]。李志华和张亚婷[87]研究发现，搅拌系统中RNA/DNA（以荧光的相对面积表征）和脱氢酶活性均高于无搅拌系统，实验结果表明适度搅拌可以提高污泥厌氧消化系统中微生物活性。段小睿等[88]研究发现，当搅拌速率为60～80r/min 时有利于污泥的水解酸化；可见，在该搅拌速率下有利于水解酸化细菌的生长。而Cubas 等[89]研究结果表明，当搅拌速率为800r/min 时可达到最佳的厌氧消化效果。显然，搅拌技术有利于促进厌氧体系中微生物的活性，从而提高厌氧消化效率。但也有研究发现，在搅拌过程中会导致反应器中物料浓度存在分布不均的现象，使得反应器中局部地区物料浓度过高，最终抑制细菌的活性[90]。

3 分子生物技术在微生物研究中的运用

随着分子生物学的快速发展，使分子生物学技术广泛地应用于分析活性污泥中的微生物群落结构。其中，使用非传统培养的方法进行直接分析活性污泥微生物的多样性，可以较为真实地反映环境样品中微生物群落结构。当前，常用的分子生物技术主要包括：末端限制性酶切片段长度多态性分析技术、克隆文库技术、高通量测序技术等。

3.1 末端限制性酶切片段长度多态性分析技术(T-RFLP)

T-RFLP 技术是由RFLP 发展而来的方法，又称16S rRNA 基因的末端限制性片段，它是将聚合酶链反应（PCR）引物中的一条加以荧光标记，对扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳，根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同来分析群落的结构及组成[91]。T-RFLP 技术不仅具有快速、高度的可重复性、良好的可操作性等优点，而且还能与适当的数据库建立直接联系，快速准确地得到有关微生物的重要信息和评估菌株间微妙的基因差别，便于揭示微生物群落的结构和功能[92]。虽然T-RFLP 技术具有许多优点，但仍存在部分缺点。如对短片断分析能力较弱、步骤较多和酶切条件难以控制[93]，因此使整个种群的多样性被大大低估，从而影响计算结果和分析指数的准确度[94]。同时，由于数据库中功能基因库的不完善，使得某些出现在T-RFLP中的RTF可能找不到匹配的对象[95]。

3.2 克隆文库技术

克隆文库技术不仅能用于分析样品中微生物的种类及所占比例，而且还能检测实验室内无法培养的微生物，再对文库中的基因序列进行测定，最终获得样品中所含基因的种类和相对数量[96]。目前克隆文库技术已经广泛应用于环境中微生物的研究，常用的是核糖体RNA 基因克隆文库的构建，主要包括16S rDNA基因克隆文库、真菌18S rDNA基因克隆文库及真菌ITS 基因克隆文库。其中，16S rDNA 克隆建库技术较成熟；但该技术具有成本较高、操作复杂、耗时较长的缺点，而且克隆数目对于环境中的微生物多样性有较大影响[96]。

3.3 高通量测序技术

高通量测序技术被称为下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）[97]，不仅能一次并行测定几十万到几百万条DNA 分子的序列，而且还能深入、细致分析一个物种的基因组。虽然高通量测序技术已发展到第三代，但由于第二代测序技术具有重复性好、精确性高、不需构建文库、无克隆误差等优点，因此第二代测序技术仍然被广泛应用于环境中微生物多样性的检测。此外，二代测序的测序广度和深度也较克隆文库技术大大提高，尤其是提高了数量上占少数的微生物群落的覆盖，这不仅能揭示微生物群落的组成变化，还能从更细的微生物分类水平上显示微生物群落的具体变化[98-101]。当前，第二代测序技术主要是应用罗氏454公司的GSFLX测序平台[102]、ABI公司的SOLID测序平台[103]和Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer 测序平台[104]。与第二代测序技术相比，虽然第三代测序技术能缩短运行时间和提高数据读取速度，而且在测序过程也无需进行PCR 扩增[105]。但该技术尚未成熟，因此在国内外测序公司中运用较少。

4 展望

通过了解厌氧消化体系中微生物群落结构的演替，不仅有助于保证厌氧消化体系的稳定和高效运行，而且还对进一步提高厌氧消化体系的性能具有重要的理论意义。同时，对厌氧体系中功能微生物特性的挖掘，还能够发现具有降解有毒有害物质功能的新型微生物；从而促进微生物修复技术的应用。近年来，随着蛋白质组学、宏基因技术和稳定同位素探针技术等分子生物学技术的不断发展，对部分有毒有害物质具有降解能力的厌氧功能微生物逐渐被发掘。虽然厌氧消化体系中功能微生物的研究取得了不同程度的进展，但仍有大量菌群尚未确定，尤其是细菌中含有大量尚未分类的菌种；这极大地限制了关于功能微生物的研究。目前研究热点主要集中在重要功能微生物种群随环境条件的变化趋势、群落结构和功能之间的关联、营养物质对厌氧微生物种群结构影响以及主要门类微生物的功能等方面。就未来发展趋势而言，今后的研究主要集中在以下几个方面：①采用蛋白质组学、宏基因技术和稳定同位素探针技术来深入了解厌氧体系中对有毒有害物质具有降解效能的功能微生物，并完善功能微生物的培养技术，以便于揭示微生物的生理生化特性；②可通过筛选和培养厌氧体系中出现的新型微生物，并将其进行分离培养以分析该菌属在厌氧体系中的功能；③深入分析现有厌氧消化体系中已检出丰度较低的菌属，揭示该菌属在体系中的功能。