蒋雨洲，陈顺辉，李文卿*，刘青丽，李志宏，张云贵

1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；

2 福建省烟草专卖局烟草科学研究所，福州 350013

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在有机质分解、营养循环、植物生长的促进或抑制等方面均发挥着重要的作用[1]。施肥年限、施肥类型和土壤本质等因素，都会对土壤微生物活性、基因表达、生物量和群落结构产生不同影响，最终表现为对农田有害、有益和无影响的结果[2]。因此，研究施肥对农田土壤微生物群落的影响有着重要意义。

施肥作为最为广泛的管理方式，可改变土壤养分状况和土壤微生物群落结构，从而影响土壤质量、生物肥力、生产力以及农田生态系统的稳定性[3-4]。土壤养分与微生物处于动态的相互作用中：一方面，土壤养分作用于微生物影响土壤微生物种群关系[5-6]。吴迪等[7]研究认为，施肥会提高根际土壤细菌、真菌和放线菌数量；Xun等[8]研究发现长期施用有机肥或有机无机配施能够维持土壤细菌的多样性，而长期施用无机肥能够显著降低土壤细菌多样性；Lovell等[9]研究认为，长期施用无机氮肥会降低土壤微生物活性。另一方面，微生物也能作用于土壤养分[10-11]，微生物量在养分循环及释放方面具有重要地位，能直接反映土壤的肥力状况[12]。吕卫光等[13]通过盆栽和田间研究表明，长期黄瓜连作使土壤微生物群落结构发生改变，造成土壤养分不平衡，促使土壤磷过剩，钾消耗过多。目前，有关化学肥料对土壤微生物量和微生物群落结构和功能多样性的影响较为复杂，研究结果不尽一致。土壤微生物对化肥的反应，依赖于养分是否抑制微生物的生长和活性[14]，不当施用化肥不利于改善土壤整体的生物性质[15]。

稻草还田和饼肥施用是南方烟－稻轮作体系下重要的烟田有机质补充措施。贾海江[16]研究表明，覆盖还田和翻压还田能够提高烤烟干物质积累量和质量。黄平娜等[17]通过3年连续田间试验表明，稻草还田不仅能提高烟叶产量，还有利于提高烤烟的产值，促使上、中等烟叶比例达到90%。有研究指出饼肥配施对烤烟烟叶品质形成具有重要作用[18-19]。韩锦峰[20]研究结果表明饼肥氮和化肥氮各占50%的配比效果最好。张焕菊[21]研究证明30%有机肥+70%复合肥时为佳,其他减肥比例会对烤烟生产带来不同程度的不良影响。已有研究主要针对当季稻草还田或饼肥施用对烤烟生产的影响研究，而关于8年的长期定位施肥条件下稻草还田或饼肥施用对烟田土壤细菌群落结构和丰度的影响尚未见报道。本文主要探讨长期定位稻草还田和饼肥施用对烟田土壤细菌群落的影响，旨在为烟田施肥和耕作制度优化，提高土壤可持续生产力提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点和品种

试验在福州市晋安区宦溪镇福建省烟草科学研究所科研基地进行，2009年开始进行定位施肥处理。2008年水稻收割后试验田0～20 cm耕层土壤基本养分含量分别为：有机质28.96 g/kg，碱解氮144.66 mg/kg，速效磷 5.85 mg/kg，速效钾 142.43 mg/kg，pH 5.76。土壤类型为沙壤土。微生物取样于2017年6月15日进行。供试烤烟品种为翠碧1号。

1.2 试验设计与管理

从2009年烤烟生产季开始，将田块分成3个小区，每个小区350 m2，分别设置3个处理，不设重复。T1：常规施用化肥对照处理，每年水稻收割后所有稻秆清除出田；T2：常规施用化肥+稻草回田处理，在T1处理施肥的基础上，水稻收割后所有稻秆粉碎回田处理；T3：常规施用化肥+稻草回田+饼肥处理，在T2处理的基础上移栽前施条沟肥时增加施用饼肥300 kg/hm2。各处理每年晚稻收割后均进行溶田。每个处理2009—2013年烤烟生产季施用90 kg/hm2。化肥 氮，N：P2O5：K2O ＝ 1：0.75：2.63；2014-2017年烤烟生产季施用97.5 kg/hm2化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；（肥料分别为烟草专用肥N：P2O5：K2O＝12：8：22，复合肥N：P2O5：K2O＝15：15：15；硝酸钾N：P2O5：K2O＝13：0：38和硫酸钾含K2O 51%）；基肥：追肥=60：40。2017年度饼肥全氮含量3.91%，全磷含量10.7 g/kg，全钾含量11.92 g/kg。每年水稻季施用96.3 kg/hm2氮肥，70.5 kg/hm2的 P2O5和 26.25 kg/hm2的 K2O， 肥 料种类分别为碳铵、过钙（有效磷≥12%）、复合肥（N：P2O5：K2O＝15：15：15）和水稻专用肥（N：P2O5：K2O ＝ 12：6：7）。

1.3 样品采集

1.3.1 土壤理化性质测定样品采集

在2017年烤烟施肥移栽前，各小区按梅花5点取0～20 cm耕层土壤混合样，剔除杂质后，并过5 mm筛，风干待测定土壤常规理化性质。6月30日烟叶采收结束后每处理距离烟株15 cm处取3个烟畦纵切面土壤（2 cm厚度）混合样，风干后测定其化学成分。

1.3.2 土壤细菌多样性测定样品采集

在2017年6月15日，烤烟收获季取植烟根际土壤，每个处理小区各取样3次重复，剔除杂质后并过2 mm筛，装于封口袋冷冻保存，进行功能基因多样性分析。

1.4 样品的测定

土壤理化性质测定采用常规分析的方法。有机质采用硫酸-重铬酸钾法，pH采用电位法，全氮采用半微量凯氏法，全磷采用氢氟酸-高氯酸消化法-钼蓝比色法，全钾采用氢氟酸-高氯酸消化-火焰光度法，碱解氮采用扩散皿法，速效磷采用磷碳酸氢钠法或盐酸-氟化铵法，速效钾采用乙酸铵提取-火焰光度法，阳离子交换量（CEC）采用1 mol/L乙酸铵交换法。

土壤样品由北京奥维森基因科技有限公司进行高通量测序，准确称取0.25 g土壤样品，使用MOBIO公司的试剂盒（PowerSoil®DNA Isolation Kit）提取土壤DNA。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。将PCR产物采用Caliper LabChip仪器，用荧光定量试剂HT DNA 1K Reagent Kit，PerkinElme进行检测定量。获得纯化的DNA后对细菌的16SrRNA基因V3～V4区通过Illumina平台的MiSeq进行高通量测序，测序试剂盒为Miseq®Reagent Kit v3（600 cycle）（PE 300）；引物为336F/808R（GTACTCCTACGGAGGCAGCA，GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

1.5 计算方法和数据分析

Miseq测序得到双端序列数据，根据不同测序数据类型选用不同的参考数据库用usearch软件去除嵌合体，通过mothur去掉长度较小的tags。对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列。采用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。所用软件为：Trimmomatic、FLASH、Pear、usearch。

试验数据经EXCEL 2010整理后作图，并用SPSS 11.5软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 有机肥长期定位施用对土壤化学性质的影响

由表1可见，经过连续8年的定位施肥，3个处理水稻收割后土壤有机质和pH值均较明显下降；碱解氮、速效磷含量和T1（常规施用化肥）对照处理的速效钾含量均明显上升。与T1处理相比，T2（化肥+稻草回田）和T3（化肥+稻草回田+饼肥）处理对有机质、碱解氮和速效钾有着影响，但使pH值明显下降， T2处理速效磷含量下降，T3处理速效磷含量上升。说明在稻草还田基础上并添加饼肥后，能够改善烟田土壤化学性质综合指标，而单独采用稻草还田，更有利于改善烤烟土壤化学性质综合指标。

表1 不同施肥处理田烟土壤化学性质的影响Tab.1 Chemical properties of flue-cured tobacco soil under different fertilizer treatments

2.2 有机肥长期定位施用对烟田土壤微生物α多样性的影响

如图1所示，与长期单一施化肥的T1处理相比，稻草还田T2处理能够提高烟田土壤中chao1指数，而再增加饼肥的T3处理则降低烟田土壤中chao1指数，但3个处理间无显著性差异。说明，在试验时间范围内不同处理对土壤细菌α多样性影响较小。

图1 不同施肥处理烟田土壤中细菌α多样性chao1指数分析Fig.1 α-diversity chao1 index of microorganisms in tobacco field soil treated with different fertilizers

2.3 有机肥长期定位施用对烟田土壤中微生物群落结构的影响

如图2可知，3个处理共测得1871个OTU。T1和T2处理的共有OTU个数最多，为63个；而T1和T3处理的共有OTU个数与T2和T3处理相等，均为58个。T1处理独有OTU个数最少，为11个；而T2和T3处理的独有OTU个数相等，均为13个。说明烟-稻轮作体系下，长期稻草回田或长期稻草回田后加施饼肥均对烟田独有细菌种类的影响较小。

图2 不同施肥处理烟田土壤中微生物OTU数的Venn图Fig.2 Venn of microbial OTUs in tobacco field soil treated by different fertilizers

2.4 有机肥长期定位施用对烟田土壤中微生物组成的影响

试验的3个处理共鉴定出12个门、19个纲、33个目、51个科、63个属。从表2可见，细菌所占比例较高（相对丰度＞5%）的主要4个菌门，依次分别为Proteobacteria＞Acidobacteria＞Chloroflexi＞ Actinobacteria，分别介于29.82%～33.41%、15.34%～19.61%、13.26%～13.47% 和 11.56%～13.10%之间。T1处理Proteobacteria的相对丰度为29.82%，T2和T3处理分别比T1处理增加了6.80%和12.02%；T1处理Acidobacteria的相对丰度为19.61%，T2和T3处理分别比T1处理减少了9.57%和21.79%；Chloroflexi的相对丰度T1处理为13.26%，T2处理比T1处理增加了1.56%，T3处理比T1处理减少了0.26%；Actinobacteria的相对丰度T1处理为11.56%，T2和T3处理分别比T1处理增加了5.73%和13.36%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞5%）的主要5个菌纲，依次分别为Acidobacteria＞Alphaproteobacteria＞Actinobacteria ＞Gammaproteobacteria ＞Ktedonobacteria，分别介于14.45%～18.96%、15.57%～16.06%、7.66%～9.48%、5.90%～9.92%和6.18%～6.55%之间，Acidobacteria的相对丰度T1处理为18.96%，T2和T3处理分别比T1处理减少了11.01%和23.79%；Alphaproteobacteria的相对丰度T1处理为16.06%，T2和T3处理分别比T1处理减少了0.89%和3.06%；Actinobacteria的相对丰度T1处理为7.66%，T2和T3处理分别比T1处理增加了7.83%和23.88%；Gammaproteobacteria的相对丰度T1处理为5.90%，T2和T3处理分别比T1处理增加了34.43%和68.30%；Ktedonobacteria的相对丰度T1处理为6.18%，T2和T3处理分别比T1处理增加了6.05%和3.93%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞5%）的主要3个菌目，依次分别为Rhizobiales＞Acidobacteriales＞Xa nthomonadales，分别介于9.30%～9.67、7.49%～9.80%和5.44%～9.52%之间。Rhizobiales的相对丰度T1处理为9.67%，T2和T3处理分别比T1处理减少了3.81%和1.04%；Acidobacteriales的相对丰度T1处理为9.80%，T2和T3处理分别比T1处理减少了6.77%和23.61%；Xanthomonadales的相对丰度T1处理为5.44%，T2和T3处理分别比T1处理增加了38.30%和74.86%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞5%）的主要3个菌科，依次分别为Acidobacteriaceae_Subgroup_1＞Unknown_Family＞ Xanthomonadaceae，分别介于7.49%～9.80、4.98%～6.43%和3.33%～6.97%之间。科水平的细菌丰度在1%以上的有12个，分别为Xanthomonadaceae、Gemmatimonadaceae、Rhizobiales（Incertae_Sedis）、Anaerolineaceae、Planctomycetaceae、Bradyrhizobiaceae、Xanthobacteraceae、Chitinophagaceae、Acidothermaceae、Sphingomonadaceae、Xanthomonadales（Incertae_Sedis）和Acetobacteraceae。Acidobacteriaceae_Subgroup_1的相对丰度T1处理为9.80%，T2和T3处理分别比T1处理减少了6.77%和23.61%。Unknown_Family的相对丰度T1处理为6.43%，T2和T3处理分别比T1处理减少了12.57%和22.53%。Xanthomonadaceae的相对丰度T1处理为3.33%，T2和T3处理分别比T1处理增加了46.44%和109.74%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞5%）的主要1个菌属，为Rhodanobacter，介于2.69%～5.33%之间。T1处理Rhodanobacter的相对丰度为2.69%，T2和T3处理分别比T1处理增加了44.34%和98.15%。属水平的细菌丰度在1%以上的有9个，分 别 为 Rhodanobacter、Candidatus_Solibacter、Rhizomicrobium、Bradyrhizobium、Bryobacter、Acidothermus、Telmatobacter、Candidatus_Koribacter和Isosphaera。

表2 不同施肥处理对烟田土壤中微生物的组成Tab.2 Composition and relative abundance of soil microorganisms in tobacco planting soil under different fertilizer treatments

续表2

续表2

2.5 不同施肥处理的聚类分析

如图3可知，不同施肥处理的聚类分析，具有相似β多样性的供试样品聚类在一起，本研究各处理的结果主要聚类成两大分支，T1和T2处理的几个平行先行相聚，再依次与T3聚类。这说明稻草回田与单施化肥处理的细菌种类较接近，烟田再增施饼肥后土壤微生物多样性表现出较明显差异。

图3 不同施肥处理烟田土壤微生物的β多样性分析Fig.3 β diversity analysis of soil microorganisms in tobacco planting soil under different fertilizer treatments

2.6 不同施肥处理的细菌进化分支图

如图4可知，不同施肥处理对烟田土壤细菌进化分支有着不同的影响，从门至属的分类级别由辐射的圆圈内至外，着色为黄色的无显著差异物种所占比例较高，与之相比各处理中体现各自差异的微生物类群较少。各处理中起重要作用的微生物从门来看，T1处理起重要作用的细菌在门水平包括Elusimicrobia和Verrucomicrobia，在纲水平包括Acidobacteria、Elusimicrobia和Opitutae等；在目水平包括Nitrosomonadales、Subgroup_6和Subgroup_12等；在科水平包括Opitutales、Opitutaceae和SJA_28等。T2处理起重要作用的细菌在门水平未出现；在纲水平包括Elev_1554等；在目水平未出现；在科水平包括Methylocystaceae等。T3处理起重要作用的细菌在门未出现；在纲水平包括Flavobacteriia、Sphingobacteriia和Gammaproteobacteria等；在目水平包括Holophagaceae、DB1_14和Micrococcales等；在科水平包括Holophagales、Microbacteriaceae和Cryomorphaceae等。从而说明，单施化肥的烟田起重要作用的细菌主要是Elusimicrobia和Verrucomicrobia两个门及其门下的细菌种群；化肥＋稻草回田处理烟田土壤表现的优势细菌种群较少；而化肥＋稻草还田＋增施饼肥处理的烟田细菌在门水平未出现显著的优势种群，而在纲、目、科属水平均有较多的优势种群。

图4 不同施肥处理的土壤微生物LEf Se进化分支图Fig.4 LEf Se of soil microorganisms in tobacco soil under different fertilizer treatments

3 讨论

土壤微生物在土壤中参与有机质和各种养分的分解与转化，与土壤质量或肥力高低密切相关，而土壤细菌是土壤微生物的主要组成部分[22,23]。长期施用饼肥并覆盖稻草，可有效增加土壤有机碳和氮含量，为土壤微生物活动提供足够的碳源、氮源，并使土壤微生物数量持续增加，最终提高土壤养分有效性[24]。本试验结果表明，长期施用饼肥并覆盖稻草有利于提高烤烟土壤有机质、碱解氮和有效磷。

土壤微生物作为农田生态系统的重要组成部分，能够对长期肥料累积作用产生敏感而快速的响应，是评价土壤质量和土壤肥力的重要指标。丁建莉等[25]研究结果表明在东北黑土的长期定位试验条件下，土壤微生物多样性受施肥类型的影响，与施加有机肥处理相比，单施化肥处理的土壤微生物多样性略低。从本研究的各处理独有OTU个数看，T1处理最少，为11个，而T2和T3处理均为13个，相对增加。由于土壤细菌群落结构易受有机肥料的影响，烟田施入有机肥导致土壤理化性质和微生物活性改变，从而改变了微生物群落多样性[26,27]。从细菌α多样性chao1指数看，与单施化肥相比，T2处理细菌多样性有增加的趋势，而增加饼肥施用的T3处理细菌多样性表现下降。说明与单施化肥处理相比，由于有机物料还田为微生物代谢提供更多可供分解的植物残体，进而促进了土壤微生物活性；另一方面，有机肥物料本身也带入大量活的微生物，进而增加了土壤微生物的丰富性[28]，这与TIAN等[29]研究结果较为一致。有研究指出肥料的施用可以改变土壤微生物总量及菌群丰度[30]，单一施肥会导致微生物多样性降低[31]，Zhou等[32]研究长期单施化肥对细菌群落结构的影响指出，单施化肥会减少细菌种群的丰度，而化肥与有机肥或绿肥秸秆长期配合施用，可改良土壤结构，增加土壤微生物的数量[33]；并且土壤微生物的组成、多样性受到土壤其他各项因子（包括土壤pH、养分、碳组分含量等）的影响[34]。王光华等[35]和周岚等[36]研究显示，随施氮水平的增加，氮肥减少了土壤中细菌群落多样性及丰富度，与本研究结果一致。

Roesch等[37]研究指出农田土壤细菌微生物多样性主要为丰度最高的Proteobacteria菌属，而本研究结果表明，从细菌所占比例较高的相对丰度来看，主要的4个菌门依次分别为Proteobacteria＞Acidobacteria＞ Chloroflexi＞ Actinobacteria， 与 前人研究结果一致。Gammaproteobacteria的相对丰度在单施化肥处理较低（5.90%），与单施化肥处理相比，稻草还田处理和稻草还田并配施饼肥处理分别增加了34.43%和68.30%，与ZHAO J等[38]研究结果一致。Ktedonobacteria的相对丰度单施化肥处理较低（6.18%），稻草还田处理（6.55%）和稻草还田并配施饼肥处理（6.42%）的相对丰度在菌纲中也比较高，与康林玉等[39]的研究结果较为一致。主要原因可能是秸秆腐解过程中产生的产物（如蛋白质、糖类及维生素等）给微生物提供了丰富的营养，从而有利于Gammaproteobacteria等微生物生长。

微生物组成中，不同的菌种与土壤化学性质有着密切的关系，土壤中细菌丰富度受有机质含量的影响[40]，Proteobacteria（变形菌门）与土壤速效养分关系密切[41]，Actinobacteria（放线菌门）放线菌门菌群是土壤养分供给的主要来源[42]。与单施化肥处理相比，Proteobacteria和Actinobacteria的相对丰度在稻草还田处理和稻草还田并配施饼肥处理均有增加，而速效养分中碱解氮和速效磷含量也表现出稻草还田处理和稻草还田并配施饼肥处理均高于单施化肥处理，与前人研究结果较为一致，仅速效钾含量表现为单施化肥处理最高。由于Chloroflexi（绿弯菌门）是矿区土壤生境生态循环的重要组成，与速效钾有关[43]。而本试验研究结果表明，Chloroflexi的相对丰度在单施化肥处理中要高于稻草还田并配施饼肥处理，这一研究结果与薛银刚等的研究结果并不一致[44]，还需进一步证明。与单施化肥处理相比，Acidobacteria的相对丰度和土壤pH在稻草还田处理和稻草还田并配施饼肥处理的Acidobacteria相对丰度和土壤pH均有所降低，这与林耀奔等[45]在碱性土壤条件下研究在门水平中Acidobacteria（酸酐菌门）适宜在酸性环境中生存的结果并不一致；这可能与土壤性质有关，也可能是Acidobacteria对pH的适应有一定的范围，太低的pH反而不利于其种群的增加。

本研究通过LEf Se进化分支图还发现，在烟田微生物门水平组间差异相比，单施化肥比稻草还田和增施饼肥的Elusimicrobia（迷踪菌门）和Verrucomicrobia（疣微菌门）两个门物种较高。由于Elusimicrobia与水体溶解氧有关[46]，有机物质的微生物降解需要消耗溶解氧，农田施用稻草或饼肥增加了农田有机物质，但是在微生物降解过程中这些有机物质已经将水中的氧气提前消耗，致使溶解氧用量不够，而复氧就是为了及时补偿这种不平衡的溶解氧亏损，从而抑制了Elusimicrobia生长[47]。胡中华等[48]认为化肥污染是面源污染的一个重要方面，而Verrucomicrobia与土壤环境因素有关，本试验研究结果表明，单施化肥的烟田有显著物种Verrucomicrobia，与前人研究结果一致。虽然稻草回田再增加饼肥施用降低了chao1指数，土壤细菌多样性有所下降，但其在纲、目、科属水平均有较多的优势细菌种群出现。

4 结论

（1）不同施肥类型对植烟土壤化学性质有着不同的影响，稻草还田和稻草还田并添加饼肥能够改善植烟土壤化学性质，稻草还田并添加饼肥最有利于提高土壤有机质、碱解氮和速效钾含量，降低土壤pH值。

（2）不同施肥方式对土壤细菌α多样性影响较小，但与单施化肥相比，稻草回田或再增加饼肥有利于提高独有OTU个数。

（3）不同施肥类型对植烟土壤微生物组成的影响，细菌所占比例较高的主要4个菌门，Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi 和Actinobacteria，而Proteobacteria菌门和菌门下物种的相对丰度最高，其中与单施化肥相比，稻草回田或再增加饼肥的植烟土壤Proteobacteria菌门相对丰度高，尤其是稻草还田并添加饼肥的烟田最高。

（4）不同施肥方式对植烟土壤微生物LEf Se进化分支图有明显影响，单施化肥的烟田土壤细菌表现优势的细菌种群主要是Elusimicrobia和Verrucomicrobia两个门及其门下的细菌种群；化肥＋稻草还田处理土壤独有的优势种群较少；化肥＋稻草还田＋饼肥处理的烟田土壤在纲、目、科属水平表现较多的优势细菌种群。