李想，刘艳霞，陈风雷，孙光军，李光雷，王兴国，杨兴明，邹焱，张恒，朱经伟

1 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550000；

2 中国烟草总公司贵州省公司，贵阳 550000；

3 南京农业大学，南京 210095

土壤酶是土壤的一个重要组分，参与包括土壤生物化学过程在内的自然界物质循环，在土壤的发生发育以及土壤肥力的形成过程中具有重要作用[1]。土壤酶能够促进有机物质的分解，释放植物有效养分，土壤酶活性大小对土壤有机碳的含量具有重要影响[2]。近些年来，土壤酶活性作为表征土壤性质的生物活性指标，已被广泛应用于评价土壤中碳、氮、磷、硫等营养元素的循环转化特征，以及评价各种农业措施对土壤供肥特性的影响等方面[3]。

土壤微生物群落多样性是指土壤生态系统中所有微生物的种类、基因与环境相互作用的多样化程度[4]，主要包括物种、遗传、结构以及功能多样性[5]，丰富的微生物群落多样性不仅能缓解连作障碍，而且是维持土壤健康的保证[6]，同时土壤微生物群落多样性还可以反应土壤肥力特征[7]，对深入认识微生态系统的结构和功能以及开展微生物多样性资源的保护和利用具有重要意义[8]。

不同的施肥处理对土壤的影响是显著不同的[9]，近年来有大量研究表明，长期施用有机肥可提高土壤酶活和微生物的数量、活性[10]。Liu等[11]发现长期施用有机肥可以显著提高团聚体中的酶活性，彭智良等[12]研究表明饼肥腐植酸处理烟田根际与非根际土壤中的细菌数量增加较多，根际放线菌数量在烟株生长中后期增加较多，施用有机肥后对土壤中真菌的数量影响较小。刘艳霞等和滕桂香等研究发现对苗床期烟苗根际施用生物有机肥可以提高微生物数量，使得烟草根系表明形成“微生物生物防御层”，防止或减少病原菌的侵入[13-14]。

21 世纪以来，新一代高通量测序技术迅猛发展，可直接测序16S DNA基因的PCR产物，每次分析获得的基因序列数以百万甚至亿万计，不仅通量高，而且能够同时分析上百个不同的样品，是解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度的重要工具[15]。探究土壤微生物群落在长期不同施肥处理下的发展变化，对克服烟草连作障碍、针对性的调节土壤微生物群落具有重要意义，因此本文采用长期定位不同施肥处理，开展植烟土壤酶活性以及微生物群落多方面的研究，为后续土壤生物修复奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤

在贵州省五大烟叶种植区域取样，分别为毕节、遵义、黔西南州、黔东南州和铜仁市，供试土壤均为黄壤（表1）。

表1 样品概况Tab.1 Sample overview

续表1

1.1.2 供试品种

烤烟品种为云烟85。

1.2 试验设计

采用多年定点施肥试验，各施肥处理均处理3年，施肥处理为3种，无机肥处理（I）：只施用烟草专用复合肥料（N : P2O5: K2O = 10 : 9 : 24）975 kg·hm-2；有机肥处理（O）：只施用有机肥2321.4 kg·hm-2；化肥配施有机肥（M）：在施用817.5 kg·hm-2烟草专用复合肥料基础上加施375 kg·hm-2的有机肥。各试验点施肥处理相同，各处理氮磷钾含量保持一致，纯有机肥和无机配施有机肥处理磷和钾不足部分分别用过磷酸钙和硫酸钾补齐，纯有机肥处理和无机配施有机肥处理中的有机肥均采用秸秆有机肥（以玉米秸秆为主要原料和菜粕经高温堆肥发酵制成），含有 机质 638 g·kg-1、N 42.0 g·kg-1、P2O522.6 g·kg-1和 K2O 10.8 g·kg-1。

1.3 取样方法

在贵州省五大烟叶种植区域于烟苗移栽55 d后采用“五点法”采集正常生长烟田的根际土壤样品，将烟草根系整体取出，轻轻抖动去除根圈土壤。将根及根表附着的土壤一起放入超声仪中进行超声处理，超声在水里的土壤即为根际土壤样品[16]。土壤样品信息见表1。

1.4 土壤样品理化性状测定方法

土壤的全N和有机碳含量通过Elementar高精度元素分析仪测定；pH采用FiveEasy Plus™ pH计（Mettler Toledo）测定，土壤过氧化氢酶、脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶测定方法参考文献[17-19]。

1.5 土壤DNA提取及PCR反应

土壤DNA采用Soil DNA Isolation Kit（Omega）提取，土壤DNA提取物采用无菌水稀释至1×10-3μg/μL。以DNA为模板，根据测序区域的选择进行PCR扩增。引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R，引物采用515F：5´-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3´和806R：5´-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3´。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用GeneJET 胶回收试盒（Thermo Scientific）回收产物。PCR扩增反应体系以及文库构建、测序和数据分析参见刘艳霞等[16]。

1.6 数据处理

实验数据采用 Microsoft Excel 2003 处理，显著性分析采用 SPSS Base Ver.13.0 统计软件 （SPSS，IL，Chicago，美国）进行，最小显著差异法（LSD）或邓肯（Duncan）新复极差进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对植烟土壤pH和碳氮的的影响

由表2可见，无机肥处理的土壤pH值变幅为4.97～6.68，没有＞7.5的土样，6.5～7.5的中性土壤只有1个（毕节的威宁区域），5.5～6.5的微酸性土壤有12个，＜5.5的酸性土壤有2个，均在黔东南烟区。有机肥处理的土壤pH值变幅为5.21～7.10，没有＞7.5的土样，6.5～7.5的中性土壤有7个，5.5～6.5的微酸性土壤有7个，＜5.5的酸性土壤有1个（天柱区域）。化肥配施有机肥处理的土壤pH值变幅为5.22～7.31，没有＞7.5的土样，6.5～7.5的中性土壤有3个，5.5～6.5的微酸性土壤有10个，＜5.5的酸性土壤有2个。贵州5个植烟区域土壤有机肥处理的pH值显著高于无机肥处理，有机肥处理的pH值比无机肥处理增加6.89%，化肥配施有机肥处理与其他两处理之间无显著性差异。

土壤的有机碳含量采用土壤养分分级评价体系[20]中的有机质指标进行判断（下同），无机肥处理的土壤有机碳含量变幅为1.54%～2.96%，土壤有机碳1.72%～2.87%的样品有11个，占全部重复的73.33%。有机肥处理的土壤有机碳含量变幅为1.11%～3.69%，土壤有机碳＞2.87%的样品有5个，土壤有机碳1.72%～2.87%的样品有8个。化肥配施有机肥处理的土壤有机碳含量变幅为1.36%～3.03%，土壤有机碳＞2.87%的样品有3个，土壤有机碳1.72%～2.87%的样品有10个。有机肥处理的平均有机碳含量比无机肥处理增加21.29%，具有显著性差异，化肥配施有机肥处理与其他两处理之间无显著性差异。

表2 施肥处理对植烟土壤pH、碳氮的影响Tab.2 Effects of fertilizer treatments on pH,carbon and nitrogen content in tobacco growing soil

无机肥处理的土壤全氮含量变幅为0.14%～0.34%，平均为0.25%，土壤全氮＞0.2%的样品有11个，占无机肥处理样品的73.33%。有机肥处理的土壤全氮含量变幅为0.14%～0.34%，平均为0.25%，土壤全氮＞0.2%的样品有13个，占有机肥处理样品的86.67%。化肥配施有机肥处理的土壤全氮含量变幅为0.16%～0.30%，平均为0.23%，土壤全氮＞0.2%的样品有11个，占化肥配施有机肥处理样品的73.33%。贵州省植烟土壤各施肥处理全氮含量无显著性差异。

2.2 不同施肥处理对贵州省植烟土壤样品酶活特性的影响

无机肥处理的土壤过氧化氢酶平均为12.28 mg·g-1·min-1（表3），有机肥处理的土壤过氧化氢酶平均为13.47 mg·g-1·min-1，化肥配施有机肥处理的土壤过氧化氢酶平均为11.82 mg·g-1·min-1，遵义、黔西南以及铜仁土壤过氧化氢酶均表现出O＞M＞I，黔东南则表现为相反的趋势；无机肥处理的土壤脲酶平均为212.12 IU，有机肥处理的土壤脲酶平均为261.88 IU，化肥配施有机肥处理的土壤脲酶平均为255.59 IU，除毕节外，其他各区域土壤的有机肥处理脲酶明显高于无机肥处理；无机肥处理的土壤酸性磷酸酶平均为23.10 U·L-1，有机肥处理的土壤酸性磷酸酶平均为26.82 U·L-1，化肥配施有机肥处理的土壤酸性磷酸酶平均为28.63 U·L-1，除黔西南外，其他区域的化肥配施有机肥处理土壤酸性磷酸酶活性明显高于无机肥处理；无机肥处理的土壤蔗糖酶平均为14.47 mg·g-1·min-1，有机肥处理的土壤蔗糖酶平均为17.08 mg·g-1·min-1，化肥配施有机肥处理的土壤蔗糖酶平均为19.62 mg·g-1·min-1，各区域（除遵义外）的化肥配施有机肥处理土壤蔗糖酶活性均明显高于其他施肥处理。化肥配施有机肥处理的所有酶活性变异系数均小于其他施肥处理，有机肥处理变异系数除蔗糖酶活性外其他酶活性均小于无机肥处理。

2.3 不同施肥处理对土壤微生物OTUs的影响

2.3.1 不同施肥处理对土壤微生物总OTUs数量的影响

有机肥处理的土壤微生物的OTUs显著高于无机肥处理（图1），比无机肥处理增加27.63%。

图1 施肥模式对土壤微生物OTUs总量的影响Fig.1 Effect of fertilization mode on total amount of OTUs in soil microorganism

2.3.2 不同施肥处理对特有土壤微生物OTUs数量的影响

有机肥处理土壤微生物特有OTUs数量比化肥配施有机肥处理增加43.55%（图2），是无机肥处理的2.48倍，化肥配施有机肥处理土壤微生物特有OTUs数量是无机肥处理的1.73倍。特有的OTUs数量占OTUs总量分别为21.17%（有机肥处理）、16.98%（化肥配施有机肥处理）和11.04%（无机肥处理）。

图2 施肥模式对土壤微生物特有OTUs的影响Fig.2 Effect of fertilization mode on soil microbial characteristic OTUs

表3 施肥处理对土壤酶活性的影响Tab.3 Effects of fertilizer treatments on soil enzyme activity

2.4 不同施肥处理对土壤微生物属水平的聚类分析

有机肥处理与化肥配施有机肥处理在属水平聚类关系最近（图3），无机肥处理与其他两种施肥处理关系较远。无机肥处理的Gemmatimonadetes属微生物OTUs丰度高于其他施肥处理，有机肥处理的micromonospora属微生物OTUs丰度高于其他施肥处理，化肥配施有机肥处理sulfuritalea、Sphingobium属微生物OTUs丰度明显高于其他施肥处理。

图3 不同施肥处理下各产区土壤微生物OTUs丰度聚类图Fig.3 Cluster diagram of soil microbial OTUs abundance in different producing areas under different fertilizer treatments

2.5 不同施肥处理对土壤微生物门水平物种丰度的影响

由图4、5中可以看出前10种优势微生物的丰度分布，全省范围来看有机肥处理的变形杆菌门（proteobacteria）、酸杆菌门（acidobacteria）相对丰度高于其他处理，各施肥处理的放线菌门（Actinobacteria）相对丰度无明显差异，无机肥处理的绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度相对高于其他施肥处理，化肥配施有机肥处理的拟杆菌门（Bacteroidetes）微生物相对丰度高于有机肥处理和无机肥处理，无机肥处理的芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和硝化螺旋菌门（nitrospirae）相对丰度较高，各施肥处理螺旋体菌门（saccharibacteria）和疣微菌门（verrucomicrobia）相对丰度差异不大。各区域（除遵义外）的有机肥处理的变形杆菌门（proteobacteria）相对丰度比无机肥处理高，遵义、毕节和黔东南区域的有机肥处理酸杆菌门（acidobacteria）相对丰度高于无机肥处理。

图4 不同施肥处理下贵州省土壤微生物门水平上的物种相对丰度分布Fig.4 Relative abundance distribution of soil microbial population in phylum level in Guizhou Province under different fertilizer treatments

图5 不同施肥处理下不同区域微生物门水平上的物种相对丰度分布Fig.5 Relative abundance distribution in different regions under different fertilizer treatments

3 讨论

不同的施肥处理主要影响土壤pH、有机质、全氮等指标，贵州省15个试验点通过连续3年的不同施肥处理后，有机肥处理的pH值显著高于无机肥处理，其pH值比无机肥处理提高6.89%，表明长期施用有机肥可有效缓解土壤酸化[21]，同时无机肥处理的微酸性土壤占样品总数的75%，由于土壤pH值与土壤抑病性呈负相关的关系，因此长期施用无机肥的土壤易导致土传病害的爆发[22-23]。经过3年定点施肥处理，有机肥处理可以提高土壤有机质含量，同时其全氮含量与无机肥处理之间无明显差异，这与Liu等的研究结果基本一致[24]。

长期不同施肥处理对土壤的酶活力影响差异较大，本研究发现施用有机肥（有机肥和化肥配施有机肥处理）可明显提升脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，而无机肥处理主要提高过氧化氢酶活性。Nayak等[25]研究表明堆肥+化肥处理脱氢酶和脲酶活性明显高于化肥处理，Poll等[26]也报道施用农家肥显著提高土壤团粒的蔗糖酶活性，长期施用有机肥和有机无机配施均显著提高土壤脲酶、蔗糖酶以及碱性磷酸酶活性[27]，化肥处理只会显著提高土壤过氧化氢酶活性[28]，但也有研究发现生物炭与氮肥配施能够提高过氧化氢酶的活性[29]，主要原因是本研究采用的有机物料为发酵完全的有机肥，土壤微生物的利用机制与生物炭显著不同，进而导致土壤过氧化氢酶活性表现存在差异。

本研究发现有机肥可以明显提高OTUs数量，尤其是特有微生物的OTUs数量，有机肥处理特有的OTUs数量占OTUs总量的21.17%，高于化肥配施有机肥处理（16.98%）和无机肥处理（11.04%），这可能由于有机肥为微生物提供充足的碳氮营养及其他营养进而增加其土壤特有微生物的数量[30]。研究还发现三种施肥处理共有OTUs数量占无机肥处理OTUs总量的66.02% ，这也说明无机肥处理的土壤微生物群落容易失衡，种群趋于单一化[31]，土壤微生物群落多样性、均匀度降低[32]。

土壤微生物OTUs水平聚类分析能够揭示不同处理间的相似或差异性[16]，本研究通过对不同施肥处理对土壤微生物属水平的聚类分析发现，有机肥处理与化肥配施有机肥处理关系最近，无机肥处理关系与其他两种施肥处理比较远，进而表明有机肥对微生物群落的影响要大于无机肥对其的影响[9]，因此可以利用有机肥改变土壤微生物的群落结构[10]，有机肥加入特定功能菌株制成生物有机肥调控根际土壤微生物数量、群落功能多样性和结构多样性[11]，再结合综合防控措施平衡根际土壤微生物群落进而使烟草土传病害发病率显著下降[12]。本研究发现施用有机肥的处理土壤微生物属水平上优势微生物丰度种类要少于无机肥处理（图3），进一步说明施用有机肥后的土壤微生物群落平衡性要好于只施用化肥的[16]。

土壤功能微生物的多少直接表征土壤营养转化能力以及抗病能力[33]，从图4中我们发现，纯有机肥处理的变形杆菌门（proteobacteria）、酸杆菌门（acidobacteria）相对丰度相对高于其他处理。变形杆菌门主要具有固氮功能，变形杆菌门的增多有利于土壤氮素的有效转化[34]，酸杆菌门主要是降解动植物残体以及参与铁载体的循环，酸杆菌门的增多可以一定程度加速土壤微生物铁载体的循环，促进植物诱导抗性反应[35]。前人研究发现通过添加微生物铁载体（pseudobactin）处理水稻，可限制稻瘟病菌的进一步扩散，提高水稻抗病性[36]，也有研究表明有益微生物可通过释放铁载体，限制了病原菌的生长[37]，降低了土传病害的发生[38]。纯无机肥处理的硝化螺旋菌门（nitrospirae）相对丰度相对高于其他施肥处理，其作为硝化细菌可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，故而增加土壤硝酸根含量，容易导致土壤的盐渍化和酸化[39]。

4 结论

通过长期的有机肥施用可以缓解土壤酸化、增加土壤有机质含量、提升土壤的酶活性，有机肥和化肥配施有机肥两种施肥处理均能改善土壤微生物群落的平衡性和丰富度。