李文艳，张娜, 李晓宁，刘纯甫，梁子腾，仲飞，管越强

(1．河北大学 基础医学院，河北 保定 071002； 2． 河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071000；3．河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；4．河北大学 公共卫生学院，河北 保定 071002)

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一种在自然界中广泛分布的可寄生于宿主细胞内外的人兽共患病原菌，严重感染时可造成妊娠动物和孕妇流产[1-2]，但其作用机理尚不清楚.研究证实，妊娠过程中母胎界面存在由多种细胞和细胞因子构成的网络，网络的动态平衡是妊娠得以成功的必要条件[3-5]，其中Th1和Th2 型细胞因子的动态平衡起着重要的作用[4-5].Th1细胞因子可激活细胞免疫和炎症的发生，促进免疫杀伤，不利于妊娠的进行，主要包括白细胞介素-2(interleukin, IL-2) 、IFN-γ和TNF-α等，Th2细胞因子介导B细胞增殖和抗体的产生，有利于妊娠的进行，主要包括IL-4 、IL-6 和IL-10等[5].正常妊娠应是Th2 细胞因子占优势，并且Th1和Th2细胞因子维持在动态平衡的状态，一旦这种平衡被破坏，就可能导致流产的发生[5].LM致小鼠流产是否与母胎界面Th1和Th2细胞因子失衡有关，目前尚不清楚.因此，本实验分别用野生型(wild type，WT)和重要毒力因子溶血素O (listeriolysin O，LLO)基因缺陷型(Δhly)菌株感染妊娠小鼠和小鼠巨噬细胞，统计其胚胎存活率，检测母胎界面和巨噬细胞培养基中Th1和Th2细胞因子的表达水平，探讨母胎界面免疫失衡在LM致小鼠流产中的作用，为临床LM致流产的防治提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 菌株和实验动物

LM菌株和小鼠巨噬细胞系B6分别由Kyoto大学医学研究科Masao Mitsuyama博士和Massachusetts大学医学院Katherine Fitzgerald教授惠赠，ICR小鼠购自北京实验动物中心.

1.2 主要试剂

小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10 ELISA 试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；细菌培养所用的琼脂和胰蛋白胨分别是Sigma和Oxoid公司产品；脱水牛心浸粉和脑浸粉为北京奥博星公司产品；细胞培养所用的DMEM培养基购自Gibco BRL公司；胎牛血清为索莱宝公司产品.

1.3 动物处理

挑选6周龄发情母鼠与正常公鼠1∶1合笼，次日清晨挑取妊娠小鼠随机分组，每组8只，共7组，其中6个实验组和1个对照组，妊娠第6.5天，对照组尾静脉注射0.2 mL磷酸盐缓冲液，实验组分别尾静脉注射0.2 mL的LM/WT或ΔhlyLM 菌悬液，最终注射剂量为5×104、5×105、5×106CFU/只，分别代表低、中、高3种不同剂量. 3 d后小鼠颈椎脱臼处死，解剖后统计小鼠胚胎存活率，取子宫角加入到组织裂解液中裂解，离心取上清液用于细胞因子的检测.

1.4 LM对巨噬细胞的感染

将小鼠巨噬细胞B6接种于96孔细胞培养板中，分成3组：对照组、LM/WT感染组和ΔhlyLM 感染组，对照组加入基础培养基，2个感染组分别加入含LM/WT或ΔhlyLM的基础培养基(2种LM与细胞的感染比均为40∶1)，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养30 min，再用含50 μg/mL庆大霉素的培养基培养1 h以杀死细胞外的细菌，最后用V-15培养基培养12 h，收集培养基，离心取上清液用于细胞因子的检测.

1.5 胚胎存活率的计算

按下列公式计算各实验组的胚胎存活率：

胚胎存活率=正常胚胎数/(被吸收的胚胎数+正常胚胎数)×100%.

1.6 组织和培养基中细胞因子的测定

采用酶联免疫分析试剂盒对子宫组织和巨噬细胞培养基中的细胞因子进行测定：按照试剂盒说明书操作，反应终止后，在酶联免疫检测仪上读取450 nm波长下的OD值，绘制标准曲线，计算各种细胞因子的含量.

1.7 统计分析

使用SPSS17.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比较进行统计分析.

2 实验结果

2.1 LM对小鼠胚胎存活率的影响

LM/WT和ΔhlyLM感染妊娠小鼠后统计小鼠胚胎存活率，结果如图1所示.与对照组相比，LM/WT感染组小鼠胚胎存活率显著下降，并且随着感染剂量的增加胚胎存活率降低；ΔhlyLM感染组与对照组相比，高、中、低剂量组胚胎存活率均没有明显变化，说明LM可诱导小鼠流产的发生，并且LLO在其中发挥着重要的作用.

*代表与对照组相比差异显著(P<0.05)；**代表与对照组相比差异极显著(P<0.01)；代表感染剂量由低到高依次为低、中、高剂量组.

2.2 LM对妊娠小鼠子宫中Th1和Th2细胞因子的影响

为探讨LM诱导的小鼠流产是否与母胎界面Th1和Th2细胞因子失衡有关，检测了LM/WT和ΔhlyLM感染后小鼠子宫组织中主要Th1和Th2细胞因子水平. Th1细胞因子检测结果显示(图2)，无论是高剂量还是低剂量LM/WT感染的妊娠小鼠，子宫组织中IL-2和IFN-γ水平都显著高于对照组(P<0.05)，并且与感染剂量呈正相关，而ΔhlyLM感染妊娠小鼠后，与对照组相比，各个感染组子宫中IFN-γ和IL-2含量无显著差异(P>0.05)，即LM/WT在诱导妊娠小鼠流产的同时也诱导了子宫中IFN-γ和IL-2含量的增加，ΔhlyLM没有诱导妊娠小鼠流产的同时也没有诱导子宫中IFN-γ和IL-2含量的增加，说明LM诱导的小鼠流产与其诱导的母胎界面Th1细胞因子增加相关，而LLO在其中发挥着重要作用.

*代表与对照组相比差异显著(P<0.05)；代表感染剂量由低到高依次为低、中、高剂量组.

Th2细胞因子检测结果显示(图3)，与对照组相比，无论是感染LM/WT还是ΔhlyLM后的小鼠子宫中IL-4水平均升高而IL-10水平均降低，但是差异都不显著(P>0.05)，说明LM/WT和ΔhlyLM感染均没有诱导Th2细胞因子(IL-4，IL-10)发生显著变化.

代表感染剂量由低到高依次为低、中、高剂量组.

2.3 LM对小鼠巨噬细胞分泌Th1和Th2细胞因子的影响

巨噬细胞是母胎界面主要的免疫细胞，为了检测巨噬细胞是否参与了母胎界面Th1和Th2型细胞因子的变化，用LM感染小鼠巨噬细胞B6后，ELISA检测培养基中Th1和Th2细胞因子的水平.

Th1型细胞因子检测结果显示(图4a,b)，LM/WT感染组培养基中IL-2和IFN-γ的水平都高于对照组，且差异极显著(P<0.01)；ΔhlyLM感染组和对照组相比没有显著差异.Th2细胞因子检测结果显示(图4 c,d)，与对照组相比，LM/WT感染组培养基中IL-4水平明显升高(P<0.05)，IL-10的水平明显降低(P<0.05)；ΔhlyLM感染组培养基中IL-4和IL-10水平与对照组相比没有明显变化.

*代表差异显著(P<0.05)；** 代表差异极显著(P<0.01)；NS代表无显著性差异(P>0.05).

3 讨论

LM感染可引发人和动物流产，其对人类生殖健康和畜牧养殖业的影响不容忽视，但LM致流产的机制尚不清楚.妊娠过程中母胎界面Th1/Th2细胞因子的平衡是维持妊娠正常进行的保证，Th1/Th2细胞因子失衡是妊娠失败的一个重要原因[6-8].因此，本研究通过分析LM感染后妊娠小鼠胚胎存活率与子宫中Th1和Th2细胞因子的相关性探讨了Th1和Th2细胞因子的变化在LM致流产中的作用.

LM感染妊娠动物后个别Th1或Th2细胞因子表达发生变化已有一些报道[9-11]，但是多种Th1和Th2细胞因子综合在一起进行免疫动态平衡的分析还未见报道，因此本实验通过检测LM诱导的流产小鼠子宫中4种有代表性的Th1和Th2细胞因子水平综合来探讨Th1/Th2细胞因子平衡与妊娠的关系.结果表明，LM感染妊娠小鼠诱导了流产小鼠母胎界面主要Th1细胞因子水平的升高，从而诱导Thl与Th2型细胞因子的平衡偏向Th1型，过量的 Th1 型细胞因子一方面降低保护性的Th1抗胞内感染的应答，导致感染不愈，另一方面进一步激活NK 细胞和巨噬细胞，使其产生更多的 Th1 型细胞因子和炎症介质，加重对胚胎的伤害，从而危及妊娠[5,7-8].

在妊娠过程中，母胎界面的巨噬细胞作为一种免疫细胞参与妊娠的建立和维持局部免疫反应，在整个妊娠中维持较高水平，在妊娠早期占子宫蜕膜免疫细胞总数的30%～35%，并且随着妊娠的发展逐渐增加[12]，推测它分泌的细胞因子与其他免疫细胞分泌的细胞因子一起影响着妊娠结果.因此，在体内实验的基础上，检测了LM感染对小鼠巨噬细胞分泌的Thl和Th2型细胞因子水平的影响，结果显示LM感染诱导了小鼠巨噬细胞的Thl型细胞因子水平明显升高，使细胞外Thl/Th2细胞因子的平衡偏向Th1型，与体内实验结果基本一致，说明巨噬细胞分泌的细胞因子在LM诱导的母胎界面Th1/Th2细胞因子失衡中发挥着重要的作用.

已知LM在感染宿主细胞的过程中，毒力因子LLO发挥着重要的作用[13].为了验证LLO在LM致流产中的作用，分别用LM/WT和ΔhlyLM感染妊娠小鼠和巨噬细胞，结果发现，ΔhlyLM没有诱导小鼠流产的发生，同时没有改变母胎界面Thl/Th2型细胞因子的平衡，说明LLO在LM诱导流产小鼠母胎界面Thl/Th2细胞因子失衡过程中发挥着重要的作用.

综上，LM通过LLO诱导的小鼠流产与母胎界面Th1/Th2细胞因子失衡相关，其中巨噬细胞分泌的细胞因子水平的改变在这种失衡中发挥着重要的作用.