韩 笑，单 伟

1．锦州医科大学基础医学院解剖学教研室(锦州 121000)；2.辽宁省健康产业集团抚矿总医院心内科(锦州 121000)

流行病学调查发现，与心血管相关疾病所导致的患者死亡位居全球第一位，其中各种因素所导致的心脏冠状动脉狭窄，从而引起的心肌梗死(Miocardial Infarction，MI)是致病因素之一[1]。急性心肌梗死时，目前临床的主要治疗方法是介入和搭桥手术，这有效降低了心梗患者的病死率。然而，大部分心梗患者术后会逐渐发生心肌缺血坏死相关的慢性并发症，从而导致心室重构，其不仅增加了心梗术后康复的难度，也严重干扰了患者的生活质量[2]。值得注意的是，随着我国人口老龄化的不断加快,老年患者的心梗发病率也逐渐升高，且老年人心功能比青壮年差，在相同程度下的冠脉栓塞下，老年患者的情况更为糟糕[3]。黄连素(Berberine，BBR)是黄连的有效成分，目前其在临床上常用于治疗细菌性胃肠炎和痢疾等炎症相关疾病[4]。研究发现，黄连素有着良好而又温和的抗炎作用，且不良反应小，目前在神经系统，消化系统等疾病中已经被大量证实[5-6]。然而，黄连素在老年心梗后的抗炎作用研究甚少，且分子机制还不明了。因此，本研究在探讨黄连素在老年心梗后对心肌细胞的抗炎作用，及抑制心室重构的分子机制。

材料和方法

1 材 料 本实验用于构建心肌梗死模型的老年大鼠(SD雄性大鼠，年龄：18个月)由锦州医科大学实验动物中心提供，所有实验方法及步骤均符合锦州医科大学伦理委员会的要求。心肌梗死模型老年大鼠40只，按照以下方式分组，每组20只，生理盐水对照组，黄连素治疗组。黄连素从sigma公司购买，HE染色试剂盒及masson染色试剂盒从碧云天公司购买，CD11b流式抗体(BD bioscience)，小型动物超声仪器。

2 实验方法 老年大鼠利用异氟醚麻醉后，进行左前降支丝线结扎，从而造成冠脉狭窄的心梗模型[7]，具体操作如下：异氟醚麻醉后连接呼吸机保证供氧量，开胸后找到心脏表面的冠状动脉左主干分支的左前降支，并用9号丝线永久性结扎。结扎后会发现心肌组织逐渐变白，此为造模成功的标志。之后观察心脏正常跳动后进行逐层缝合，缝合后第二天进行黄连素溶液的尾静脉注射[浓度为10 μg/ml，用PBS溶解；100 mg/(kg·d)][8]，注射后大鼠继续饲养。之后每天注射一次黄连素溶液，注射28 d停止注射，并在治疗1周后，对每组老年大鼠进行超声心动图检查，从而评估大鼠心脏功能。

Masson染色：老年大鼠腹腔注射10%水合氯醛过量麻醉后，逐层开胸，小心取出心脏，清洗后采用4%多聚甲醇(PFA)固定过夜，再用30%蔗糖溶液脱水，3 d后石蜡包埋、切片。按Masson三色法染色试剂盒说明书进行以下步骤：脱水、苏木精染色、丽春红、磷钼酸处理、苯胺蓝染色、分化、树脂封片处理后，在显微镜下观察老年大鼠左心室间质蓝色所示的纤维化程度。

HE染色：如上所示步骤，采用苏木素和伊红进行HE染色。处理后，在显微镜下观察老年大鼠左心室组织大体恢复程度。

荧光半定量PCR(Q-PCR)检测不同分组老年大鼠心脏内的白介素-6(IL-6)，趋化因子( Ccl2)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)的表达量。设计引物如下，GAPDH：5’- AGCCCTCCCTTCTCTCGAAT-3’5’- CCCCACAACACTGCATTCAC-3’；IL-6：6 5’- AGCGATGATGCACTGTCAGA-3’5’- TAGCACACTAGGTTTGCCGA-3’；Ccl2 5’- GATCCCAATGAGTCGGCTGG-3’5’- ACAGAAGTGCTTGAGGTGGTT-3’；TNF-α： 5’- GGCTTTCGGAACTCACTGGA-3’5’- CCCGTAGGGCGATTACAGTC-3’PI3K： 5’- CCCGGGTAGGTTTGAATTCGTT-3’5’- ATGCCCTAGGTGACCTGACA-3’。采用经典的Trizol方法提取老年大鼠心脏的总RNA，并进行逆转录，根据RevertAid RT Reverse Transcription Kit(ThermoFisher Scientific)的说明书，准确定量1 μg逆转录为cDNA。荧光半定量分析：依次加入样本的cDNA，引物模版，及Q-PCR mix，从而进行荧光半定量分析。

3 统计学方法 本实验结果均采用GraphPad Prism 9.0 对数据进行处理，所有结果以平均值±标准误的形式显示。两组结果之间的比较采用two-tailed Student’s t-test进行检测。显著性水平定为双侧α=0.05。

结 果

1 黄连素可以降低老年心梗大鼠的病死率 老年大鼠心梗模型造模成功后，每天观察大鼠的病死率情况；同时每天测量体重，发现组间没有差异(图1)。

图1 心梗术后观察不同时间点老年大鼠的病死率

2 黄连素可以有效改善老年大鼠心梗后的心功能 在心梗后第28 d，对老年大鼠进行超声心动图检测心功能，并取材观察心肌坏死的恢复程度。我们发现黄连素治疗心梗后28 d后，心脏在大体上的梗死区域与心梗生理盐水组相比减少了很多(图2A)；同时我们在超声心动图上发现，黄连素可以有效的提高LVEF (P<0.01)，并降低LVFS(P<0.001) (图2B、2C)。由此可见，黄连素可以有效促进心梗后心功能的恢复，并减少心肌梗死的面积。

图2心梗造模成功后第28天进行心脏取材，取材后进行大体观察与超声心动图检测[图A：黄连素治疗组的心梗损伤区域比盐水对照组的损伤区域有减少的趋势；图B：超声心动图中的心脏长轴部分；图C：黄连素组的LVEF比盐水对照组高(P<0.01)，而LVSF比盐水对照组低(P<0.001)。组间比较，**P<0.01，***P<0.001]

3 黄连素可以改善老年心梗大鼠的心室重构 同样在心梗造模后第28天，过量麻醉大鼠后灌流取材，进行HE和Masson染色，以此验证黄连素是否可以改善老年大鼠心梗后的心室重构问题。我们通过HE染色发现，与心梗盐水对照组相比，黄连素治疗组的组织致密，排列整齐。这反映出心梗后黄连素治疗可以一定程度上恢复心肌组织连续性等；通过Masson染色发现，黄连素可以有减少心梗后心肌组织的纤维面积(P<0.05)。这部分数据提示，心梗28 d后，黄连素可以有效恢复心梗后心肌组织连续性及致密性，也可以减少心梗导致的纤维化(图3)。

图3在做完心脏超声后，对老年大鼠进行灌流取材，之后进行HE染色和Masson染色[图A：黄连素治疗后及盐水对照组心脏的HE染色；图B：黄连素治疗后及治疗前的心脏组织的Masson染色；图C：纤维化面积比总面积的百分率，其中黄连素治疗组比盐水对照组的纤维化面积降低很多(P<0.05)。组间比较，*P<0.05]

4 黄连素可以减低心梗后局部炎症反应，这可能与PI3K/AKT信号通路相关 在造模成功后第7天，麻醉取材。我们利用流式细胞术检测大鼠整合素αM型，来反应炎性细胞在黄连素治疗后的数量变化；利用Q-PCR来检测IL-6，Ccl2，TNF-α，PI3K及苏氨酸激酶(AKT)的含量，以此来初步探究黄连素治疗心梗的分子机制。我们发现，黄连素可以有效减少CD11b阳性细胞的数量(P<0.01)；黄连素也可以有效降低IL-6，Ccl2及TNF-α的量，并且提高了PI3K的含量，同时也降低了AKT的含量。这部分数据提示，黄连素有效降低了心梗导致的心肌局部的炎症因子的含量，同时黄连素激活了PI3K/AKT信号通路(图4)。

图4术后第7天取材，进行分子生物学实验探究黄连素治疗心梗的分子机制[图A：进行CD11b流式细胞术检测，发现黄连素组CD11b阳性细胞率低于盐水对照组(P<0.01)；图B：用Q-PCR方法检测炎症相关因子IL-6，Ccl2及TNF-α的相对含量，发现黄连素组都低于盐水对照组；图C：用Q-PCR方法检测PI3K/AKT信号通路关键分子PI3K及AKT的相对含量，发现黄连素组的PI3K含量高于盐水对照组，但AKT含量低于盐水对照组(P<0.01)。组间比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001]

讨 论

研究发现，老年患者心梗后会出现心室重构，这可能与缺血后的心肌细胞分泌的炎症因子有关，这也会导致损伤区的心肌细胞发生凋亡[9]。因此，如何控制好老年患者心梗后心肌细胞的炎症反应水平，将是心梗后控制心室重构的重点与难点之一。

炎症反应是心肌梗死所导致心室重构过程中的重要病理机制之一。一方面，心肌梗死后内源性免疫系统激活，诱导大量炎症介质释放，促使炎症细胞迁移趋化至损伤的心肌组织，再次释放大量的炎性物质，促使心肌组织纤维化，最终形成瘢痕组织影响心脏收缩功能。另一方面，心梗后心肌细胞发生炎症反应，可以促进组织分泌大量炎性因子。这可以促使本身细胞与邻近细胞都发生细胞凋亡甚至是死亡，这也是为什么心梗后坏死区域会越来越大的原因之一[10]。我们的研究也发现，老年大鼠心梗后的心肌微环境中存在大量的炎症因子。因此如何降低心梗后局部的炎症反应，可能是解决心室重构问题的关键点之一。

黄连是我国传统的中药之一，在传统中医中药理论中，黄连具有泻火解毒，清热燥湿的功效[11]。适用于内治湿热痞满，泻痢，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，血热吐衄，消渴，牙痛，痈肿疔疮；外治湿疮，耳道流脓等[12]。黄连素是黄连有效成分，其具有良好而又温和的抗炎作用，且不良反应小，目前在神经系统，消化系统等炎性疾病中已经被大量证实[5-6]。但是，黄连素在老年心梗后的抗炎作用研究甚少，且分子机制还不明了。我们实验发现，黄连素可以有效的维持老年大鼠心梗后的心功能，减轻心脏纤维化，也有效的改善了组织的大体形态。

研究发现，损伤后的炎症反应会激活PI3K信号通路，这可能与机体的自身保护机制有关[13-15]。抑制此通路会有效缓解心梗后心肌的炎症反应，减轻心室重构。这可能与抑制此信号通路后，抑制肿瘤坏死因子等炎症因子释放，从而减轻了受损心肌的炎症反应有关。相似的是，我们研究发现发现心梗后应用黄连素治疗，且减少受损心肌反应的这个现象与PI3K信号通路密切相关。并且，我们应用PI3K特异性抑制剂后发现，黄连素的治疗效果基本消失。因此，我们认为黄连素抑制心梗后炎症反应，减轻心室重构可能与激活了PI3K信号通路有关。本实验探讨了黄连素在老年大鼠心肌梗死后的作用及其相关机制，但在分子机制方面探讨还有不足，具体深入的分子机制将在下一步的实验中进一步探索。

综上所述，老年大鼠在急性心肌梗死后进行黄连素治疗有利于提高心梗后心功能，减少心梗后纤维化，且抑制局部炎症反应，这些可能与PI3K信号通路高度相关。