唐春艳， 贺 英， 周杨杨， 程 强， 羿国娟， 鲁 兰

(成都大学 四川抗菌素工业研究所， 四川 成都 610052)

0 引 言

抗生素的耐药性问题是当今受到普遍关注的热点问题，作为耐药菌之一的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是临床常见的致病菌，其耐药机制与分泌的毒力因子有关，包括生物被膜生成，绿脓菌素及弹性蛋白酶分泌等，而这些毒力因子受细菌密度感应(Quorum sensing，QS)系统调控[1-3].有研究发现，Pa中至少存在2种以上QS系统，分别是以C4-HSL、3-oxo-C12-HSL为信号分子的高丝氨酸内酯系统和以喹诺酮为信号分子的PQS系统[4]，其中又以高丝氨酸内酯系统最具代表性.在该系统中，C4-HSL、3-oxo-C12-HSL分别参与上游主控基因Las、Rhl等的调控[5-7]，其与细菌耐药性和致病性高度相关，对其进行浓度测定具有重要意义.对此，本研究通过建立一种较为完整的液—质联用的方法，用于Pa培养液中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的浓度测定，并将其应用于清热解毒中药金银花水煎液对Pa的抗菌作用机制的研究中.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：C4-HSL标准品(批号，10007898，规格为10 mg)，Cayman公司；3-oxo-C12-HSL标准品(批号，09139，规格为10 mg)，Sigma公司；酮洛芬(含量为99.6%)、铜绿假单胞菌(临床致病菌株15-23)，四川抗菌素工业研究所；金银花(忍冬科植物忍冬的干燥花蕾)，成都同仁堂药店，经本实验室测定，其最低抑菌浓度(MIC)为100 mg/mL；胰酪大豆琼脂培养基(TSA，7053894)，美国BD公司；胰蛋白胨(01-002)，北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸出粉，成都科龙化工试剂厂；生理盐水，四川科伦药业股份有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：Agilent-6410B型质谱仪(美国Agilent公司)，Millipore Simplicity纯水机(美国密理博公司))，Sartorius BS-124S型电子天平(德国赛多利斯公司)，XW-80A型涡旋混合器(上海青浦沪西仪器厂)，LDZX-75KBS型立式高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，GNP-9080型隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，ZHWY-100B型恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)，麦氏比浊管(广东环凯微生物科技有限公司)，DW-86L490型低温冰箱(青岛海尔集团有限公司).

2 方法与结果

2.1 溶液与平板制备

2.1.1 金银花水煎液制备

称取干燥金银花10 g，用洁净纱布包好置于砂锅内，加去离子水500 mL，浸泡30 min，大火煮沸，小火继续煎1 h，倒出药液，再加500 mL去离子水，按上述方法再次煎制.将2次药液合并后浓缩至10 mL，其浓度相当于生药量1 000 mg/mL，121 ℃灭菌30 min.实验时，现配现用.

2.1.2 培养平板制备

称取TSA培养基4 g，加去离子水100 mL，121 ℃高压灭菌30 min，制备TSA平板，备用.称取胰蛋白胨1 g，酵母浸出粉0.5 g，氯化钠1 g，加去离子水100 mL，调pH值至7.0，121 ℃高压灭菌30 min，制备肉膏蛋白胨(LB)培养液，备用.

2.2 分析方法

2.2.1 色谱和质谱条件

1)色谱条件.色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×100 mm，2.7 mm)，流动相为80%乙腈—20%水(含0.1%甲酸)；流速为0.2 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为2 μL.

2)质谱条件.采用ESI源，在负离子电离模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描方式；测定C4-HSL的检测离子为m/z 172.2→102.1，3-oxo-C12-HSL的检测离子为m/z 298.3→197.2，毛细管电压3 500 V，碎裂电压为90 V；酮洛芬的检测离子为m/z 255.1→209.1，碎裂电压为70 V；干燥气为氮气，干燥气流速10 L/min，温度350 ℃，雾化室压力30 psi.C4-HSL、3-oxo-C12-HSL及酮洛芬的质谱图见图1.

2.2.2 对照品溶液配制

分别精密称取C4-HSL与3-oxo-C12-HSL对照品各10 mg，置25 mL量瓶中，用去离子水配制成400 μg/mL的C4-HSL母液及400 μg/mL的3-oxo-C12-HSL母液，取C4-HSL与3-oxo-C12-HSL母液适量，用去离子水配制成系列对照品溶液，浓度分别为0.40、1.00、2.00、4.00、6.67、10.0、20.0、40.0 μg/mL.实验时，现配现用.

精密称取酮洛芬对照品适量，用甲醇配制成50μg/mL溶液，作为内标(IS)溶液，备用.

2.2.3 样品处理

取0.22 μm过滤后的培养液样品2 mL，加入10 μL酮洛芬内标溶液，混匀，再加入4 mL经甲酸酸化的乙酸乙酯溶液(含0.5%甲酸)，涡旋提取3 min，静置分层，取有机相3 mL，氮气挥干，加入200 μL甲醇复溶后进样测定.

图1 3种物质的质谱图

2.3 方法验证

2.3.1 专属性

按“2.2.1”项下色谱和质谱条件，分别测定空白LB培养液、含C4-HSL与3-oxo-C12-HSL LB培养液、金银花水煎液与铜绿假单胞菌作用后LB培养液，结果见图2.结果表明，LB培养液中的内源性物质不干扰C4-HSL，3-oxo-C12-HSL以及内标酮洛芬(IS)的测定，C4-HSL，3-oxo-C12-HSL和酮洛芬的保留时间分别为3.6 min、5.5 min和4.4 min，本方法具有较高的灵敏度和特异性.

2.3.2 标准曲线及定量限

取若干份空白LB培养液2 mL，分别加入浓度为0.40、1.00、2.00、4.00、6.67、10.0、20.0、40.0 μg/mL的C4-HSL与3-oxo-C12-HSL系列对照品溶液10 μL，制备成分别含C4-HSL与3-oxo-C12-HSL浓度为2.00、5.00、10.0、20.0、33.4、50.0、100、200 ng/mL溶液，按“2.2.3”项下方法处理后测定.以C4-HSL与3-oxo-C12-HSL浓度为横坐标，C4-HSL、3-oxo-C12-HSL与内标的峰面积比为纵坐标，制备标准曲线.C4-HSL标准曲线为，Y=0.0043X-0.0045(R=0.9964)，3-oxo-C12-HSL标准曲线为，Y=0.0019X+0.007(R=0.9997)，C4-HSL与3-oxo-C12-HSL线性范围均为2.00～200 ng/mL，定量下限(LLOQ)均为2 ng/mL.

图2培养液中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL和酮洛芬IS的液—质色谱图

2.3.3 精密度与准确度

按“2.3.2”项下方法，取适量C4-HSL及3-oxo-C12-HSL系列对照品溶液，用空白LB培养液制备成含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4个浓度的样品作为质量控制样品，每一浓度各20份，每日分别取4个浓度各5份，按“2.2.3”项下方法处理后进样测定，连续测定3 d，计算批内、批间精密度和准确度，结果见表1、表2.

表1 培养液中C4-HSL的精密度与准确度(n=5)

表2 培养液中3-oxo-C12-HSL的精密度与准确度(n=5)

结果表明，C4-HSL和3-oxo-C12-HSL样品的批内、批间精密度RSD<7.5%，符合生物样品测定要求.

2.3.4 提取回收率

按“2.3.2”项下方法，取适量C4-HSL及3-oxo-C12-HSL系列对照品溶液，用空白LB培养液制备成含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4个浓度的样品作为质量控制样品，每一浓度各5份，按“2.2.3”项下方法处理后进样测定，分别记录C4-HSL、3-oxo-C12-HSL峰面积AC4提取、AC12提取.另取2 mL LB空白培养液，加入酮洛芬内标溶液10 μL后混匀，加入经甲酸酸化的乙酸乙酯溶液(含0.5%甲酸)4 mL，涡旋提取，取3 mL有机相，氮气挥干，再分别加入适量C4-HSL与3-oxo-C12-HSL系列对照品溶液10 μL，氮气挥干，制成相当于提取前含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度，含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60 ng/mL 4个浓度的样品作为未经提取样品，每一浓度各5份.按“2.2.3”方法加入200 μL甲醇复溶后进样测定，分别记录C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的峰面积AC4未提取、AC12未提取，以均值比值AC4提取/AC4未提取、AC12提取/AC12未提取表示C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的提取回收率.

在本条件下，C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度样品提取回收率分别为87.77±8.39%、89.16±6.04%、88.91±3.72%、91.47±9.56%；3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60 ng/mL 4个浓度样品提取回收率分别为79.04±8.08%、83.03±6.55%、82.87±4.01%、81.60±3.69%.结果表明，样品的回收率符合生物样品测定要求.

2.3.5 基质效应

按“2.3.2”项下方法，另取2 mL纯水代替2 mL LB空白培养液，制成含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度的不含基质的C4-HSL样品和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4个浓度的不含基质的3-oxo-C12-HSL样品，每一浓度各5份.按“2.2.3”方法加入200 μL甲醇复溶后进样测定，分别记录C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的峰面积BC4、BC12，以均值比值AC4未提取/BC4、AC12未提取/BC12表示C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的基质效应.

在本条件下，C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度的基质效应分别为86.8±2.31%、93.6±1.72%、91.3±2.67%、91.7±4.84%，3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60 ng/mL 4个浓度的基质效应分别为82.8±4.67%、80.2±3.33%、86.3±6.40%、85.8±4.78%.结果表明，LB培养液基质对C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的测定无影响.

2.3.6 样品稳定性

按“2.3.2”项下方法制备含C4-HSL 3.34、10.0、33.4、80.0 ng/mL 4个浓度的和含3-oxo-C12-HSL 3.34、10.0、20.0、60.0 ng/mL 4个浓度的质量控制样品，每一浓度数份，分别考察于室温放置2 h、样品处理后4 ℃放置24 h、-70 ℃冻存15 d和-70 ℃冻融循环3次的稳定性，结果见表3、表4.结果表明，样品在上述条件下稳定性良好，符合生物样品测定要求.

2.4 金银花水煎液抗铜绿假单胞菌作用

2.4.1 信号分子浓度测定

取铜绿假单胞菌复苏于TSA平板，37 ℃培养24 h，

表3 C4-HSL在培养液中的稳定性

表4 3-oxo-C12-HSL在培养液中的稳定性

取单个菌落于无菌生理盐水中调至5.0麦氏比浊度，用LB液体培养液稀释10倍，37℃、150 r/min培养24 h后再用LB液体培养液稀释30倍，作为稀释剂备用.取灭菌后生药量为1 000 mg/mL的金银花水煎液适量，用上述稀释剂稀释10倍至金银花水煎液浓度为100 mg/mL，再依次稀释至6、25、100 mg/mL 3个浓度(分别相当于1/16、1/4、1×MIC)，作为含药组；同法制备不含金银花水煎液的溶液作为空白对照组.含药组和空白对照组每组6份，取各组溶液6 mL于相应试管中，37 ℃，150 r/min培养48 h，取培养液3 mL测定其中信号分子C4-HSL和3-oxo-C12-HSL浓度.

2.4.2 对信号分子浓度的影响

金银花水煎液与铜绿假单胞菌共同培养48 h后，含药组培养液中信号分子浓度与空白对照组比较，结果见表5、图3.

表5 C4-HSL和3-oxo-C12-HSL在培养液中的浓度

注：*P<0.05，**P<0.01.

图3 C4-HSL和3-oxo-C12-HSL在培养液中的浓度

结果显示，C4-HSL浓度明显降低，3-oxo-C12-HSL浓度明显升高，此提示即便在亚抑菌浓度条件下，金银花水煎液也能对铜绿假单胞菌的信号分子浓度产生显著的影响(P<0.05或P<0.01)，进而对细菌产生耐药性的基因进行调控.

3 讨 论

目前，Pa密度感应系统中信号分子的液—质联用测定方法虽有少量文献报道，但均选择相同子离子m/z 102.1进行测定，且很不完整，也未见系统的方法学评价[8-10]，在应用于中药抗耐药菌机制研究中，由于中药成分复杂，离子通道容易出现相互干扰而影响测定.本研究针对Pa密度感应系统中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL信号分子建立了不同子离子的液—质联用测定方法，较好地克服了离子通道的干扰问题.在方法学研究中，由于不能获得不含C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的空白菌液，因此以空白LB培养液作为基质来进行评价，结果完全符合生物样品测定要求，体现了本方法的适应性.同时，从清热解毒中药金银花水煎液对Pa密度感应系统中信号分子作用的实验结果可见，本方法能准确测定Pa培养液中C4-HSL、3-oxo-C12-HSL的浓度变化，其中，C4-HSL浓度与空白对照组比较明显减小，3-oxo-C12-HSL浓度明显增加， 提示金银花水煎液中可能同时存在能抑制Rhl通路和激活Las通路的成分，体现了中药多组分、多靶点、协同作用的特点，此也可为抗Pa耐药机制研究提供参考.