张 鸿，陈 炜

铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院感染最常见的病原体之一[1]。铜绿假单胞菌的毒力分泌系统共有5型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型。细菌可以通过毒力分泌系统适应生存环境、向宿主细胞注入毒力因子、逃避宿主细胞的吞噬等，以此达到生存、复制、感染、传播的目的[2]。目前，普遍认为Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS）与铜绿假单胞菌急性感染密切相关，是铜绿假单胞菌感染宿主细胞并致病的最关键、最复杂的毒力系统[3]。

1 T3SS的结构与功能

T3SS在耶尔森菌属、沙门菌属、福氏志贺菌、幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌等革兰阴性菌中广泛存在[4]，1996年首次发现铜绿假单胞菌的T3SS，2005年确定结构，其结构高度保守，其装置横跨细菌内外膜，并延伸形成针状结构，针状结构顶端还有一个接触宿主细胞膜形成孔道的易位复合体。因T3SS总体结构与医用注射器形状相似，故又将T3SS复合体装置称为T3SS注射体（injectisome）[5]。

该注射体由约3 0 种蛋白组成，根据功能可将组成蛋白分为4 类，即细菌膜装置蛋白（bacterial membrane apparatus protein）、转位子蛋白（translocon protein）、效应蛋白（effector protein）和分子伴侣（chaperone）[4]。细菌膜装置蛋白是T3SS的结构基础，其装配过程犹如现代工厂般有条不紊。首先是“生产零件”，即由相关基因表达产生蛋白，如PscN、YscJ等；然后是“结构部件组装”，即按照结构需求将蛋白组装成环状、杆状等；最后是完成“总体组装”，即各个结构部件在细菌内外膜上有序组装形成具有功能活性的注射体。转位子蛋白主要是指与宿主细胞接触并可注射细菌毒素或蛋白的部分，又可称为膜孔复合体，主要由Pcr V[6]、Pop B/Pop D复合体[7]组成。虽然细菌在适应环境过程中可以产生诸多特异性的效应蛋白，但铜绿假单胞菌T3SS效应蛋白目前发现并公认的有以下4种，即胞外酶U（ExoU）、胞外酶S（ExoS）、胞外酶T（ExoT）和胞外酶Y（ExoY），近期有研究称发现了新的效应蛋白PemA、PemB，但是其具体功能尚不明确[8]。由于编码ExoU和ExoS的基因相互排斥，故两者几乎不在同一菌株中同时出现[9]，携带不同基因的铜绿假单胞菌在致病性、耐药性等方面存在差异[10]。铜绿假单胞菌T3SS效应蛋白均具有一定的酶活性，如ExoU具有磷脂酶A2活性，可导致宿主细胞快速裂解；Exo T和Exo S合成序列之间具有高度同源性，其C-端具有ADP-核糖基转移酶（ADPRT）结构域，N-端具有GTP酶激活蛋白（GAP）结构域。有报道，ADPRT和GAP结构域对于ExoT在靶上皮细胞中的细胞毒性均有作用，而ExoS诱导的细胞凋亡则主要是依靠ADPRT 活性[11]。ExoY具有腺苷酸环化酶活性，体外实验证明Exo Y具有促进感染细胞过度磷酸化、阻碍血管修复等毒性作用[12]。这些效应蛋白不仅可以促进铜绿假单胞菌对宿主细胞膜的损伤、抑制宿主炎性介质介导的免疫反应，还可以阻碍宿主细胞损伤后修复过程。T3SS的分子伴侣多为小分子（＜20 kDa）酸性蛋白，可特异性地与效应蛋白结合，保护效应蛋白在宿主胞质内不被降解，从而顺利地完成分泌和转移[4]。

研究表明，T3SS是铜绿假单胞菌急性感染建立和传播必备的主要毒力因子[1，11]，其致病作用主要来源于：①T3SS被激活时，其针状结构与宿主细胞接触，膜孔复合体顶端的PcrV、PopB/PopD蛋白复合体可在宿主细胞膜上打孔，破坏宿主细胞膜的完整性[13]。有研究证明，即使当T3SS分泌蛋白基因被抑制时，T3SS依然可以对宿主细胞膜造成损伤；②T3SS还可以编码IpaA、IpaB等蛋白，与宿主细胞膜整合素进行整合[14-15]，促进宿主细胞膜形成伪足吞噬铜绿假单胞菌，从而巧妙地逃脱宿主上皮细胞、巨噬细胞等细胞的吞杀；③T3SS效应蛋白具有酶活性[9-12]，可以破坏宿主细胞的正常代谢，破坏宿主细胞的细胞骨架，在体内引起炎症级联反应，甚至杀死中性粒细胞，导致宿主局部免疫功能抑制，诱发细胞凋亡，促进铜绿假单胞菌在宿主体内大量繁殖与播散，从而诱发宿主发生感染播散或复数菌感染。总之，T3SS可以通过多种方式和途径参与细菌致病过程。

2 T3SS的调控机制

T3SS相关基因的有序表达是其功能实现的前提，是铜绿假单胞菌在宿主体内生存、繁殖和播散的基础。铜绿假单胞菌T3SS的43个编码基因中，与分泌、转位和调节相关的5个操纵子（p s c U T S R Q P O N、p o p N-p c r 1 23 4 D R、p cr G V H-p o p B D、e x s C E B A和e x s D- p s c B C D E F G H I J K L）在染色体上彼此相邻形成了毒力岛，而编码效应蛋白、分子伴侣的基因则位于染色体的其他位置 [16]。

2.1 ExsA对T3SS的调控

T3SS的所有基因均受转录因子Exs A直接调控，其结合位点位于靶基因转录起始点上游约51～52个碱基处的TNAAAANA保守序列[17]。Exs A是一种Ar a C转录激活子，可通过毒力岛操纵子exs C E B A和exs D-ps c B C D E F G H I J K L实现自调控。e x s C E B A可编码蛋白Exs C、Exs E 和Exs A，exs D- psc B C D E F G H I J K L可编码ExsD。当ExsD与ExsA结合时可抑制ExsA的DNA结合活性，从而抑制T3SS转录；而当Exs C与Exs D结合时，可以促进Exs D释放Exs A，从而间接促进T3SS转录；当ExsE与ExsC结合时，又可以促进ExsC释放ExsD，Exs D与Exs A恢复结合，从而对T3SS起到抑制作用[18-19]。ExsE除了可以与ExsD直接结合抑制T3SS外，还可作为分泌蛋白直接与ExsA结合促进T3SS表达。其作为分泌蛋白调控ExsA的过程可受到多种因素影响，如宿主接触、血清接触等，其中生存环境中Ca2+浓度的影响最为显著[20]。当铜绿假单胞菌处于高Ca2+环境时，蛋白质分泌受到抑制，ExsE在胞内大量囤积，通过直接与ExsD结合，从而抑制T3SS的表达；当铜绿假单胞菌处于低Ca2+环境时，可促进ExsE的分泌，从而使T3SS处于高表达水平。当然，Ca2+的调控作用并非如此单一，还可以通过环磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）途径实现对T3SS的调控[21]。

2.2 cAMP对T3SS的调控

2 0世纪6 0年代早期，c AMP在液化短杆菌（Brevi bact erium l i que faci ens）的研究中作为信号分子被首次识别，目前人们认为c AMP是细菌中广泛存在的信号分子[22]。它是靶细胞在第一信使作用下产生的第二信使，由腺苷酸环化酶产生，可通过蛋白磷酸化作用并结合CRP家族转录因子[23]，从而发挥信号转导的功能。铜绿假单胞菌中与c AMP结合的CRP转录因子是Vfr（virulence factor regulator）（PA0652）[24]。有证据表明，与野生菌株相比，当c AMP或Vfr缺失突变时，铜绿假单胞菌约有200个基因表达水平会下调[25]。由此可见，cAMP的作用范围甚广，有报道称cAMP与铜绿假单胞菌的群体感应系统、细胞外蛋白酶、外毒素A、Ⅳ型菌毛、Ⅱ型分泌系统、Ⅲ型分泌系统、las群体感应系统等多种毒力因子的调控有关。有遗传互补实验证明，过量表达ExsA可以弥补vfr基因或cAMP合成基因缺失突变的影响，但是vf r基因或cAMP合成基因过量表达不能弥补exsA基因缺失突变的影响，证明vfr基因或cAMP合成基因是在ExsA上游或平行水平对T3SS进行调节。至于到底是作用于ExsA上游还是与ExsA平行调节，科学家进行了大量研究，近期有人通过凝胶迁移实验确定了Vfr的DNA结合位点，证明Vfr是通过与exsA上游的启动子PexsA结合对T3SS进行调控[26]。

2.3 双组分系统及小RNA对T3SS的调节

双组分系统（t wo-c o mpo n e nt r e g ul a t o r y syst em，TCS）是上世纪80年代Nixon等[27]研究大肠埃希菌氮调节蛋白系统时发现的一种跨膜信号转导系统。该系统在细菌、真菌、原虫及一些植物中广泛存在，其主要作用是识别外界信号并将信号转导至胞内，从而对细胞代谢、渗透调节、致病性、耐药性、光合作用、趋化性等进行调控，经典的TCS由组氨酸蛋白激酶（hi st idi ne protein kinase，HPK）和反应调节蛋白（response regulator protein，RR ）组成，参与铜绿假单胞菌调节的有64个HPK、72个RR和3个Hpt蛋白（含有HisHis磷酸转移蛋白）[28]。对铜绿假单胞菌T3SS具有调节作用的TCS包括Ga c S-Ga c A、Gl t R、SadA-SadR-SadS、AlgB-FimS（AlgZ）等，研究最多的是GacS-GacA[29]。TCS中GacS-GacA及其下游小RNA（RsmY和RsmZ）对铜绿假单胞菌毒力因子进行调节的系统被称为GAC系统[29]。GAC系统的调控途径是：当GacS接收外界环境刺激信号后，可使Gac A发生磷酸化，磷酸化的Gac A可正向调节小RNA（RsmY和RsmZ）的表达，RsmY和RsmZ可以与诱导ExsA表达的RsmA结合，抑制RsmA活性，从而负向调节Exs A，抑制T3SS的表达。Ventre等[30]发现GAC系统中，传感器激酶LadS（PA3974）和RetS（PA4856）具有与GacS平行的作用，LadS系统可以通过GAC系统正向调控具有抑制T3SS作用的操纵子pel（PA3058至PA3064），而RetS则与Gac S之间异二聚体的形成阻断了后者的自磷酸化能力，干扰了随后向GacA的磷酸化转移，并导致RsmZ表达的减少，RsmA促进急性毒性相关基因表达，T3SS表达上调。GAC系统除了可直接对ExsA产生影响外，还可以通过RsmA对群体感应系统、生物膜形成等产生影响[31]。GAC系统还可通过对T3SS和T6SS表达的调节介导铜绿假单胞菌急性毒性和慢性毒性之间的转换[32]。

2.4 群体感应系统对T3SS的调节

1970年，首次报道了单个费氏弧菌（Vi b r i o fi sheri）不发光，细菌密度增高时发绿色荧光的现象。1983年，在费氏弧菌中找到了群体感应和基本模型[33]。从此人们对于微生物适应环境、感染致病、抵御天敌等方面的社会行为有了全新的认识，关于群体感应系统的研究也不断升温。群体感应系统是一种在细菌种内或种间通过化学信号分子彼此感知、交流、相互协调的机制[4]。根据信号分子不同，铜绿假单胞菌群体感应系统可分为las、rhl和喹诺酮（pseudomonas quinolone signal，pqs）系统[34]。三种群体感应系统之间存在一定的级联关系，pqs系统可由las系统正向调节，由rhl系统负向调节，同时pqs系统又可正向反馈调控rhl系统[35]。孔伟娜等[36]采用基因敲除的方法证明，rhl对T3SS具有负向调节作用，pqs系统对T3SS相关基因（exoS和exo T）具有负向调节作用，但是对于基因ex o Y和操纵子exs D-psc A-L没有调节作用，并且证明了pqs系统与rhl系统对T3SS的调控途径是不一样的。关于两者对于T3SS的具体调节机制目前仍不清楚。

2.5 PtrB对T3SS的调节

铜绿假单胞菌还存在一种为了生存而协调基因调节，抑制T3SS表达的情况。因为铜绿假单胞菌T3SS装置的构建、装配及分泌等过程均需要花费大量的能量，所以细菌DNA受到损伤时，该菌会启动SOS损伤修复系统。该修复系统一旦启动便可以促进PtrB蛋白产生[37]，目前有研究证明该蛋白具有抑制T3SS、促进绿脓素分泌的作用，但是其对T3SS的具体作用位点、调节机制等仍有待进一步深入研究。

2.6 ArtR对T3SS的调节

近期，Kong等[38]发现了一种不依赖于GAC调节系统的全新的T3SS调节因素，即三磷酸腺苷结合蛋白Art R。AtrR是铜绿假单胞菌PA4595基因编码的一种调节因子，由三磷酸腺苷激活后可抑制T3SS基因表达。通过实验证明，当a rt R敲除时，T3SS基因，包括exo S、exo Y、e x oT、exs C E B A和ex s D-p sc B L的表达显著增加，ArtR对Exs A的影响是在转录水平，而不是翻译水平。Art R的调节作用和细胞质定位表明它属于三磷酸腺苷结合盒家族的REG亚家族。纯化的GST标记的Art R在体外显示ATP酶活性。

3 总结与展望

铜绿假单胞菌T3SS是铜绿假单胞菌的重要病毒因子，经过无数科学家20余年的努力探索，目前已经明确了其结构模型，认识到T3SS是通过破坏宿主细胞膜完整性、诱导细胞凋亡、抑制宿主防御系统等方式来发挥急性毒性。铜绿假单胞菌拥有庞大的细菌基因组（6.3 Mb），其中有8%的编码调节基因组[39]，这预示着铜绿假单胞菌具有响应各种动态环境信号的复杂调节网络，新的调控因素及机制被不断发现，铜绿假单胞菌T3SS调控网络的大幕正在徐徐揭开。随着研究不断深入，关于T3SS的调控因素及调控机制的认知正在逐渐完善，为今后以T3SS作为铜绿假单胞菌感染防控靶点的研究提供新的理论依据。