刘小龙，杨万霞，马延龄，王 丹，陈 昊

(兰州大学第二医院 1.肿瘤外科；2.检验科，甘肃 兰州 730030)

1944年Joseph Bigger第一次提出持留菌概念，持留菌和持留表型是微生物对不利环境的一种适应性方式。抗菌药物治疗细菌感染时，几乎不可能实现完全消灭细菌，最常见的原因是耐药菌的存在。但是即使细菌对抗菌药物敏感，菌群中总是含有一小部分能够耐受抗菌药物致死活性的群体，该亚群由持留菌组成，在遗传上与其他细菌相同，但其耐受表型不同，在抗菌药物环境下进入休眠状态，表现出对抗菌药物迟钝的反应能力来逃逸抗菌药物的杀伤作用，待抗菌药物被代谢清除后，持留菌则又恢复其生长能力，导致临床治疗失败和感染复发，这是持留菌的持留特点。到目前为止，几乎所有被检测的细菌物种都已确定存在持留菌，甚至是真核微生物亦存在该表型的群体。目前研究证明，抗菌药物无法根除持留菌，进行体外抗菌药物试验发现，持留菌水平会持续升高，并且发现在疾病急性期或者早期持留菌水平较低，而在慢性感染中持留菌表达水平显著升高。这种具有逃逸性、适应性的特殊群体导致了临床迁延反复感染，给未来临床抗菌药物治疗带来巨大挑战。持久性细胞的临床意义不仅仅局限于复发感染，因为其构成一个免受致命抗菌药物杀灭的细胞亚群，在抗菌药物存在下仍然存活，并且可以积累抗性突变。这对未来抗菌药物使用具有潜在性威胁，极大危害人类健康[1]。

1 持留特性

随机形成、对抗菌药物敏感表型可逆是持留菌最大的特点，持留菌不同于耐药菌，并未发生基因突变，只是单纯抗菌药物敏感程度发生改变，在高浓度抗菌药物环境下处于静止或休眠状态，对抗菌药物呈现迟钝效应，高浓度过后又恢复对抗菌药物的敏感性，是一种特殊的高持留突变。持留菌休眠状态并非一切生理功能的停止，只是处于一种低活力状态，另外Drescher等[2]发现同一菌株在不同的环境下能诱导出不同的持留菌，可能是微生物互补的生存策略。

2 持留机制

2.1 免疫调控与持留表型 细胞因子信号转导抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族分子，能负反馈抑制细胞因子信号转导通路，SOCS-1是SOCS家族的一员，某些病原体可以通过上调SOCS-1逃避宿主免疫攻击。病原微生物被巨噬细胞、树突状细胞TLR受体识别后，启动下游信号通路发挥免疫作用，发挥抗感染作用，Mal是TLR2、TLR4的下游信号通路的主要调节靶点，SOCS-1蛋白通过对Mal进行泛素化降解抑制免疫应答，使炎症因子减少，使病原微生物逃避宿主免疫应答[3-5]。持留菌亦是通过SOCS-1抑制Mal途径发挥免疫逃逸，通过TLR4诱导SOCS-1的表达，SOCS-1沉默后解除了对Mal的抑制，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β等炎症因子表达会明显上调，形成持留菌的TLR4-SOCS-1-Mal的持留菌免疫逃逸途径[6]。

2.2 生物被膜与持留表型 大部分感染性疾病都与生物膜有关，存在于生物膜的微生物易躲避抗菌药物的清除，持留菌的持留与其菌落形成的生物膜密切相关，生物被膜在持留菌和免疫大分子之间形成屏障，亦保护持留菌免受抗菌药物侵害，与其持留作用密切相关，研究[6-8]表明持留菌产生生物被膜的能力强于无持留能力的一般细菌，如在肺炎克雷伯菌持留菌与标准菌株对比中，持留菌被龙胆紫染色显著深于对照组[6]；另外生物膜中的持留菌其数量、耐药性均强于游离持留菌[9]，当致死量抗菌药物作用时，非持留菌和游离持留菌可被杀灭，生物膜中持留菌得以生存；Grant等[10]提出“保护环境”理论，如人体一些生理性体腔、屏障等，抗菌药物难以到达或通过，又如结核分枝杆菌形成的肉芽肿，都有效躲避了药物及人体免疫系统的清除，同样生物膜亦是持留菌的“保护环境”，持留菌除了自身的耐药特性外，亦与生物膜形成的微环境密不可分[11]。

2.3 代谢与持留表型 微生物内ATP水平与持留菌的持留特性有关[12]，研究[13]表明金黄色葡萄球菌变为持留菌进入休眠状态后，细胞内的ATP水平下降，而且细胞休眠状态的标志物在抗菌药物攻击时，表达量会上升100～1 000倍，亦有试验研究[14-15]表明随着ATP消耗，持留菌的数目越来越多，为了进一步验证ATP与持留菌形成的关系，有研究[16]在培养微生物的培养基里增加ATP，发现随着培养时间延长，持留菌形成会逐渐减少。

2.4 毒素蛋白/抗毒素蛋白失衡与持留表型 毒素/抗毒素系统是研究比较成熟的持留菌持留机制[17]，毒素/抗毒素系统主要在细菌线粒体，但其功能尚未阐明，但其在持留菌的特性中发挥重要作用[18-20]。毒素/抗毒素是广泛存在于原核生物体内的一对操纵子，一个编码毒素蛋白，另一个编码抗毒素蛋白，毒素蛋白抑制遗传物质复制、蛋白翻译、细胞周期等过程[21]，抗毒素蛋白调控毒素蛋白表达并及时对其降解，其中毒素蛋白会引起持留菌的形成[22]；hipA在大肠埃希菌发现的编码毒素蛋白的基因，编码的毒素蛋白使微生物活性区域失活而增加微生物对不良环境的耐受性[23-25]。

3 持留菌的治疗

持留菌的休眠特性使多种抗菌药物治疗靶点失活，导致多种抗菌药物无法将其清除[26]，临床上治疗持留菌的方法主要有使用抗菌药物及物理、化学、生物效应等方法。

3.1 联合应用抗菌药物 联合应用抗菌药物并根据药敏试验结果调整抗菌药物的种类和剂量，或辅以抗菌药物增敏剂来达到杀灭持留菌的目的，这是临床最常用的手段[27-28]。研究[29]发现短时间内使用高剂量利福平能更快的清除小鼠结核分枝杆菌内脏感染，亦有学者发现延长抗菌药物作用时间虽然能清除病原菌，但是容易形成高突变持留菌，导致慢性感染反复[30]，说明延长抗菌药物使用时间并不可取，容易滋生持留菌。在抗菌药物使用同时，加以甘露醇、溶解态氧可有效杀灭病原菌[31-32]。

3.2 非抗菌药物

3.2.1 低水平直流电 低水平直流电对持留菌具有杀伤作用，应用70 μA/cm的直流电可以杀伤98%的铜绿假单胞菌，并且对铜绿假单胞菌持留菌呈现致死性杀伤，而且使用低水平直流电联合抗菌药物有更好的效果，具有协同作用[32]，对控制与植入式医疗器械导致的慢性感染有极大的帮助。

3.2.2 溶菌性噬菌体 持留菌在高浓度抗菌药物环境中会进入休眠状态，再次进入生长状态会引起迁延感染，溶菌性噬菌体会对重新生长阶段的持留菌杀伤，但对休眠状态的持留菌无法溶解清除[33]，从生长状态减少持留菌的形成，有效降低持留菌的数量，对控制感染具有重要意义。

3.2.3 分子抑制剂 在毒素/抗毒素体系中，毒素蛋白会可逆的抑制细胞的复制、转录及翻译，但当毒素蛋白持续作用时，细胞则会发生不可逆的生长停滞，因此，Lioy等[34]验证了通过破坏毒素/抗毒素模式的方法让毒素蛋白持续杀灭持留菌，不能再生长增殖。BF8是革兰阴性菌群体感应系统抑制物，能使持留菌从休眠状态转换为对抗菌药物敏感状态，达到杀伤持留菌的目的，C10亦可逆转持留菌的抗菌药物敏感性，改变其休眠状态[35]。

4 持留菌的重要价值

4.1 持留菌对于临床研究的意义 持留菌由于逃逸致死抗菌药物杀伤的特性，使临床很多疾病都迁延不愈，反复发作，因此，针对持留菌的持留特性，临床上已经逐渐出现很多治疗手段，如低水平直流电、溶解性噬菌体等，这些对疾病的彻底治愈都具有很好的帮助。

4.2 持留菌对于微生物种群的意义 持留表型通常被认为是微生物种群一种“赌注/保值”，从而避免种群灭绝手段，整个种群把赌注放在非生长或缓慢生长的持留菌，但这些表型变异体很好地适应未来的压力环境，从而使种群免于灭绝[36]。

5 讨论

持留菌是细菌对于外界不良环境的应激生存状态，属于一种进化形式，目前发现持留表型不仅存在于细菌，真核生物中亦出现持留菌[37]，持留菌于抗菌药物环境中变为休眠或者静止状态，呈现出对抗菌药物的惰性，待抗菌药物过后，又会重新生长增值，并且恢复其对抗菌药物的敏感性，其躲避抗菌药物的形式不同于耐药菌，且未发生基因突变。

持留菌的形成目前发现与生物膜的保护作用、胞内低ATP状态、毒素蛋白的作用、免疫调控等有关，临床亦出现了针对持留菌休眠状态的治疗方法，这对临床多种感染性疾病反复迁延的治疗很有针对性，相信不久将会有更多清除持留菌的新技术、新方法。

由于持留菌与临床治疗相关，其治疗方法主要分为抗菌药物联合治疗和非抗菌药物法，分为直接杀灭休眠状态的持留菌、使休眠状态持留菌重新获敏、干扰持留菌形成三条策略[38]。Joseph Bigger第一次发现持留菌并提及持留菌清除方法，从持留菌的状态转化角度提出，分段或者间歇性使用抗菌药物可以使持留菌从休眠状态苏醒，恢复对抗菌药物的敏感性，继而达到后续杀灭的目的，Kim等[35]发现C10和顺式-癸酸能够恢复杆菌和通路假单胞菌持留菌的休眠状态，使其重新对不同种类的抗菌药物敏感。菌膜去极化或直接破坏细胞膜，DNA交联，抑制必需酶和反应性氧化应激产生均是潜在的方法，Hurdle等[39]认为细菌双层膜及膜重要功能蛋白可作为直接杀灭持留菌的靶点，虽然持留菌特殊的休眠表型和低代谢状态，但仍需要完整的细胞膜保持其生存能力，Hu等[40]发现氟喹诺酮衍生的HT6明显抑制对非倍增金黄色葡萄球菌细胞的活性，破坏细胞膜和去极化，能够杀灭持留菌和耐药菌，增强已用抗菌药物的效果。亦有学者通过质和肽因子复苏金黄色葡萄球菌持留状态，恢复抗菌药物杀伤的敏感性。持留菌产生的原因是外界各种原因刺激，因此，抑制应激信号，干扰持留菌形成是从源头上对其进行杀灭，Starkey等[41]发现抑制假单胞菌中的群体感应调节因子MfvR可明显减少该类持留菌数目，抑制应激信号ppGpp可使多个革兰阳性菌持留菌数目减少，虽然消除现有的持留菌极大地促进有效治疗，但在抗菌药物治疗之前抑制或减少其形成可有效预防感染[38]。

本综述总结了持留菌的特点、形成机制及治疗策略和手段，希望提高临床对持留菌及其预防和治疗手段的认识，解决顽固性感染问题，减少抗药性发展的机会，减少患者的身体负担和经济负担。