雷可昕 白贺天 杨淞月 李敬 陈谦明

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院，成都 610041；2.四川大学华西临床医学院，成都 610041

环状RNA（circular RNA，circRNA）是长链非编码RNA（lncRNA）家族的一个新成员[1]。与线性RNA不同，这种RNA不具有5'甲基鸟苷帽和3'多聚腺苷酸尾的特征，而是一个共价的闭环结构，因此环状RNA对核糖核酸酶（Rnases）不敏感，这使它与线性RNA相比具有更高的稳定性[2]。根据不同的来源，环状RNA可分为外显子环状RNA（exonic circRNA）[3]、内含子环状RNA（intronic circRNA）[4]、外显子-内含子环状RNA（exon-intron circRNA）[5]，以及来源于tRNA的环状RNA（TriRNA）[6]。研究[7]表明，环状RNA广泛地参与了各种疾病的发病，其复杂多样的功能、独特的丰富性、广泛性、稳定性以及组织特异性在病理过程中发挥了重要作用，成为生物学领域的明星分子。

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）在世界最高发癌症中占到了第11位[8]。OSCC具有局部侵袭性、高复发性、易转移等特点，5年生存率低于许多实体肿瘤，仅为50～60%[9]。然而目前对OSCC的分子机制尚不清楚，尚无高敏感度、高特异性的生物标记物作为OSCC早期诊断、治疗与预后的监测指标。已有文献表明环状RNA与OSCC的恶性进程有所关联，提示着环状RNA具有作为OSCC早期诊断和生物治疗标志物的潜在功能。本文简要介绍了环状RNA的特性、生成过程，并从其生物学功能出发，讨论了它们在肿瘤，尤其是OSCC中的研究进展。

1 环状RNA的成环机制

在真核生物中，典型的剪接是由剪接体机制形成的，它去除内含子并将外显子连接成一个线性RNA转录体[10]。大多数的环状RNA来源于外显子。整个过程可分为两部分：1）一个或多个外显子对的上游内含子与下游内含子连接；2）上游内含子的2'-羟基与下游内含子的5'-磷酸基团反应，然后3'-外显子的3'-羟基与5'-外显子的5'-磷酸反应，最终形成环状RNA[11]。内含子中的ALU序列也可以相互作用，促进反向剪接[12]。一些RNA结合蛋白在这一过程中起到了调节因子的作用，例如RNA结合蛋白MBL连接近侧内含子，促进了环状RNA的产生[13]；而RNA编辑酶ADAR1抑制了环状RNA的形成[14]。此外，套索驱动的环化是另一种产生环状RNA的机制，上游剪接受体和下游供体由于RNA套索的存在而相互接近，而外显子则由5'-3'磷酸二酯键连接[15]。

2 环状RNA的生物学功能

环状RNA作为非编码RNA具有多样的功能，主要分为以下5个方面。

2.1 miRNA的海绵作用

miRNA被认为是内源性非编码RNA，它能抑制下游基因表达，进而抑制蛋白质合成。越来越多的研究[7]发现具有互补序列的环状RNA可以海绵样吸附miRNA，并抑制其下游基因表达。比如，cirs-7，又名CDR1as，是含有70个以上miR-7结合位点的环状RNA[5,16]，它能够和miR-7结合并作用于其下游的mRNA。此条分子通路轴在星形细胞瘤和肺癌等疾病中广泛表达[17]。

2.2 调控线性RNA转录

环状RNA可以促进或抑制线性RNA的转录，是选择性剪接或转录的关键调节因子。由外显子形成的环状RNA占已知环状RNA的绝大部分，它们的生成过程对传统剪接有竞争性的影响[14]。

2.3 对蛋白质的海绵作用

环状RNA也可以吸附RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBPs）来调节蛋白质水平。例如在苍蝇和人类身上发现的circ-MBL可以在多个结合位点与MBL蛋白结合[7]。

2.4 与蛋白质相互作用

越来越多的研究[18]表明，一些环状RNA也能够与蛋白质相互作用，从而影响细胞的行为。例如circFOXO3是目前受到最广泛关注的一种环状RNA，被证明是连接p21和细胞周期依赖性蛋白激酶2（cyclindependent kinases 2，CDK2）的一种适配器。circ-FOXO3促进CDK2从p21中释放出来，p21可以磷酸化细胞周期素A和细胞周期素E，从而促进细胞分裂增殖。circFOXO3高表达还可促进p53与MDM2的相互作用，进而加速p53的降解[19]。

2.5 调控蛋白翻译

虽然环状RNA缺乏5'7-甲基鸟苷帽结构和3'多聚腺苷酸尾这两种线性RNA翻译的两个基本特征，但环状RNA也可以翻译成脯氨酸或多肽。1995年初步研究[20]发现，脑心肌炎病毒核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）在人工环状RNA的翻译中起着重要作用。此外，Yang等[21]发现，RNA最丰富的修饰N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，M6A）促进了人细胞内环状RNA的翻译，提示环状RNA来源的蛋白在外界影响下起着重要的作用。

3 环状RNA与肿瘤

研究表明，环状RNA在实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，特别是通过其作为miRNA海绵的生物学功能。环状RNA参与了肿瘤发生发展的几个特征性进程，如逃避生长抑制因子、维持增殖信号、逃避细胞死亡和衰老以及具有促进血管生成、激活侵袭和转移的能力。此外，肿瘤细胞内环状RNA的异常表达、组织特异性、多样性和稳定性使其具有肿瘤标记物的巨大潜能。

在肝癌中，研究人员发现hsa_circ_0005075在60组肝癌组织中的表达与正常组织有显著差异，表明hsa_circ_0005075是潜在的生物标志物[22]。此外hsa_circ_0001649的表达也存在差异，且与肝癌肿瘤大小和癌栓的发生密切相关[23]，而circZFR、circFUT8和circIPO11被证明可用于肝癌标本的鉴别[24]。对于肺癌，临床队列研究和细胞水平研究均发现circRNAITCH在肺癌中起抑制作用。circRNA-ITCH调控异常可通过对miR-7和miR-214的海绵作用增强其亲本抑癌基因ITCH的表达，从而调节癌细胞的增殖[25]。circ-001569能海绵样吸附miR-145并上调其下游基因如E2F5、BAG4和FMNl2的表达，导致G2/M期细胞增多，肿瘤细胞凋亡减少[26]。另外，在非实体肿瘤中，Salzman等[27]偶然发现在急性髓系白血病中产生了数百个环状RNA的基因，而这些环状RNA也同时在HeLa细胞中被检测到。另外还有研究[28]证实了化疗可抑制急性髓系白血病患者hsa_circ_0004277的异常表达。

除上述肿瘤外，也有研究发现有些环状RNA与胃癌[29-31]、乳腺癌[32-33]、结肠癌[26,34]、膀胱癌[35]、卵巢肿瘤[36]、皮肤鳞状上皮癌[37]等多种癌症关系密切。

4 环状RNA与OSCC

4.1 环状RNA在OSCC中的研究现状

高通量测序的应用让越来越多OSCC特异性表达的环状RNA被筛选出来。国内有研究通过环状RNA芯片技术筛查出OSCC组织和癌旁组织中表达有显著差异的环状RNA，其中包括相对表达量比值在1.5倍以上的环状RNA 155 条。环状RNA hsa_circ_0001874显示出与肿瘤临床分期和分化程度密切相关，其在低分化的OSCC组织中表达明显高于中、高水平分化的OSCC组织[38]。通过环状RNA靶基因分析软件的预测，推断miR-103A-3P、miR-107、miR-593-5p、miR-661和miR-662可能是hsa_circ_0001874的海绵作用靶点，但具体的作用途经尚不明确。类似的研究还包括探究舌鳞状细胞癌组织与正常癌旁组织中环状RNA的表达谱特征，经过4例癌灶组织和4例癌旁组织的高通量测序，共筛选出17 171条有差异的环状RNA，其中差异高达50倍的环状RNA就有15条[39]。差异倍数116.31的上环状RNA hsa-circ-0033967经预测有163个hsa-miR-608的潜在结合位点，而hsamiR-608在近年来已经被证实为在肝癌、胶质瘤中发挥抑癌作用的非编码RNA[40]。这一发现提示了hsacirc-0033967可通过海绵作用阻碍hsa-miR-608的抑癌作用从而促进舌癌的发生发展。

一些环状RNA已经被证明在OSCC恶性进程中存在特有信号通路，具有临床应用价值。细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent kinases 6，CDK6）在一些特异性阶段通过调节转录应答促进肿瘤形成。研究[41]发现在OSCC组织中circRNA_100290水平上调并与CDK6协同表达，circRNA_100290表达缺失后会减少CDK6的表达，并抑制OSCC细胞株在体内外的增殖。circRNA_100290可以作为一个相互竞争的内源性RNA，通过海绵样吸附miR-29家庭成员促进CDK6的表达来参与口腔癌的恶性进程。Wang等[42]以CAL-7、SCC-9、SCC-25 3种口腔鳞癌细胞系为基础建立了细胞凋亡模型，对照组对比发现628种环状RNA的表达存在差异，其中circRNA DOCK1是在细胞凋亡模型中表达量显著下降的环状RNA之一，实时荧光定量聚合酶链式反应发现这种环状RNA在OSCC细胞系与组织中也存在高表达。在该种环状RNA的低表达模型中，在多种细胞凋亡通路中起重要作用的miR-193a-5p表达水平上升，与此同时凋亡率有不同程度的增加。进一步实验证明，miR-193a-5p可以与含杆状病毒IAP重复基因（baculoviral IAP repeat containing，BIRC）的mRNA结合以降低BIRC在细胞中含量，使细胞凋亡率上升，进而证实了circDOCK1/miR-196a-5p/BIRC3信号通路的存在——circRNA DOCK1可通过调节蛋白BIRC的表达间接影响OSCC的细胞凋亡，体现了circRNA DOCK1作为诊断OSCC生物标志物及治疗靶点的潜力。另有研究[43]发现，另一种环状RNA也可能辅助OSCC的诊断，hsa_circ_1001242在SCC-9、SCC-15、SCC25、CAL-27 4个口腔鳞癌细胞系中表达明显上升，且表达水平和肿瘤规模与T分期呈负相关。相似的，唾液中hsa_circ_0001874与hsa_circ_0001971在OSCC样本中的表达显著提高，更有作为OSCC肿瘤标志物判断肿瘤发展程度的潜力，因为他们的含量均与OSCC的TNM分期有关，且前者与肿瘤分级相关，恶性程度更高的样本中hsa_circ_0001874有着更高的表达水平。不仅如此，通过比较这两种环状RNA的表达水平的差异亦能区分出OSCC与口腔白斑组织，手术亦会降低2种环状RNA在唾液中的含量[44]。

4.2 环状RNA在OSCC中的应用价值

如今临床上对于OSCC在早期诊断、手术方法、放化疗治疗上都取得了一定进展，但OSCC早期症状并不典型，最终确诊往往需组织活检，临床工作中仍然缺乏快速、准确且无创的早期诊断标志物。环状RNA具有丰富性、广泛性、保守性，以及能在唾液、血液、尿液、外分泌囊泡中稳定表达的特性，并在组织器官中的表达具有阶段特异性，因此是一种极具潜力的生物标志物。由于OSCC发生部位均在口内，唾液样本的检验可能成为一种OSCC高危标志物的早期筛查诊断方法，且操作简单，无需通过侵入性操作来获得样本。一些研究[45-46]表明，唾液中的微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNAs）可作为OSCC的早期诊断标志物。由于环状RNA具有闭合环状结构，相较于长链非编码RNA对RNA酶的敏感性较低，且环状RNA的半衰期往往高于48 h，而微小RNA的半衰期平均仅有10 h，因此环状RNA作为标志物更为合适[47]。已有文献表明唾液中存在OSCC特异性的环状RNA，如前所述，OSCC患者唾液中has-circ-0001874与has-circ-0001971的含量明显增高，可使用患者唾液样本中显著高表达的特定环状RNA来作为诊断OSCC的有力证据[44]。类似的，环状RNA也可以用作OSCC环状预后的标志物，在患者经过手术或内科治疗后，这些OSCC特异性的环状RNA能作为患者定期随访的监测指标[48]。

研究[49]表明，某些环状RNA可以通过细胞内信号通路调控肿瘤细胞生物学行为，故环状RNA被认为是未来OSCC分子生物学治疗靶点之一，若可以通过药物干扰环状RNA作用通路，有望抑制OSCC细胞的增殖与促进凋亡。现如今最主要的干扰环状RNA表达的方法是通过数据库查询构建特定种类的环状RNA的靶向小干扰RNA（siRNA），将其导入OSCC细胞，可以达到等同于该种环状RNA编码基因敲除的作用，从而阻碍癌细胞或癌组织的进一步发展。研究[41]发现，在OSCC细胞株内导入circRNA-100290的靶向siRNA，通过调节环状RNA-miR29家族-CDK6通路达到抑制OSCC细胞株体内外增殖的作用。类似的，Wang等[50]通过导入环状RNA DOCK1的siRNA构建了此种环状RNA的低表达模型后发现，CAL-7、SCC-9、SCC-25 3种OSCC细胞系凋亡率上升。过分子生物学方法使促进OSCC恶性发展的环状RNA保持低表达状态有应用于临床治疗的潜力。

相反的，某些环状RNA的过表达对癌细胞增殖与癌组织发展有一定抑制作用，通过人工手段合成有特定良性作用的环状RNA并转染至细胞从而达到治疗效果已成为可能。已有学者[51]成功在体外合成可以明显抑制癌细胞增殖的环状RNA—scRNA21，这种环状RNA导入细胞内可以通过海绵作用结合miR-21，从而上调原本被miR-21靶向抑制的抑癌基因Daxx的表达，进而诱导胃癌细胞的凋亡。通过提高环状RNA的胞内含量进而影响OSCC细胞生物学行为，为治疗OSCC提供了新的思路。

4.3 环状RNA在OSCC中的现存问题

虽然环状RNA作为OSCC诊断、预后的生物标记物以及治疗的靶点都具有较高优越性，但目前的研究成果仍具有较大的局限性。如在分析OSCC患者体内差异表达的环状RNA时，样本量的大小以及样本的选取都将影响最终数据，而目前的研究成果尚不能代表所有OSCC患者情况，这些特异性的环状RNA是否具有人群的普遍适用性还需进一步研究证明。

综上所述，环状RNA作为一种刚被发现具有特殊生物学功能的分子，具有良好的特异性与稳定性，其作为肿瘤标志物的潜力已在胃癌[29-31]、结肠癌[26,34]、乳腺癌[32-33]等多种癌症中得到证明。OSCC是一种易发生转移且预后较差的癌症，且它的发生与发展机制尚不明确，在分子水平上揭示OSCC的发生与发展的进程必将对OSCC的早期诊断、治疗和预后提供更加高效与准确的方法。有关OSCC中环状RNA作用的研究也陆续出现，为肿瘤的诊断与预后提供了新思路。

虽然有越来越多在肿瘤组织与正常组织之间差异表达的环状RNA被发现，但只有很少部分的环状RNA在细胞分子机制中的确切作用得到了阐明，绝大多数环状RNA的作用机制尚无定论，仍存在大量未知等待探索。而且环状RNA的肿瘤诊断标志物作用从理论过渡到临床应用，成为一种简便、高效、准确的实验室检查方法之前，尚需大量的研究作为基础。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。