刘娟 商黔惠，2 李璐 赵宇

(1遵义医科大学临床医学研究所 心血管病研究所 高血压研究室，贵州 遵义 563003；2遵义医科大学附属医院心内科)

盐是高血压的重要易患因素之一，高盐摄入可使大鼠血压升高，同时出现血管纤维化和(或)心肌纤维化(MF)，增加心血管病的发生率〔1，2〕。研究证实，整体实验中高盐不仅可导致动物血压升高，且可引起心血管、肾等重要靶器官的损伤〔3～6〕，盐负荷加剧了各靶器官的损伤〔7，8〕。MF是多因素导致的心肌纤维持续性和反复加重的结果，是长期高血压等疾病后心肌的代偿性改变，主要表现为细胞增殖及胶原合成或分泌增加。长期高盐饮食可诱导MF的发生〔9，10〕，MF后易诱发心力衰竭等的发生，加剧MF患者的死亡率〔11〕。心脏成纤维细胞(CFs)占心脏间质细胞总数的60%～70%〔12〕，参与细胞外基质合成和代谢〔13〕。CFs在外界病理因素的刺激下，可转化为肌成纤维细胞，激活的肌成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质的能力增强，进而加剧MF〔14〕。转化生长因子(TGF)-β1主要由内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等细胞合成，可控制多种细胞的增殖、分化及刺激细胞外基质的分泌。磷酸化smad2/3(p-smad2/3)是其下游信号分子，介导TGF-β1促纤维化的效应，smad7在该信号通路中主要发挥负性调控作用〔15〕。TGF-β1/smads通路是纤维化发生的重要分子机制〔16〕。课题组前期实验表明，8%高盐诱导的Wistar大鼠左心室纤维化模型中心肌细胞增大，胶原容积分数增大，其机制与TGF-β1/smads表达异常相关〔5，17，18〕。那么，在体外实验中，高盐是否能够诱导CFs增殖和胶原分泌增加呢？是否会引起TGF-β1/smads信号通路蛋白表达异常？本研究旨在通过体外诱导实验，以SD乳鼠CFs为研究对象，对高盐致CFs增殖的Na+浓度、作用时间及胶原分泌进行初步研究，分析高盐诱导CFs发生增殖及导致胶原分泌增加的可能机制，以期为相关实验提供依据。

1 材料和方法

1.1材料 雄性SD大鼠12只，雌性SD大鼠24只，体重200 g左右〔许可证号为：SCXK-(渝)2012-0005〕，购买于中国人民解放军陆军军医大学大坪医院实验动物中心，购买后进行合笼配种，取1～3天龄乳鼠进行细胞培养；DMEM培养基购买于美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自南美MRC；CCK-8细胞增殖试剂盒购自凯基生物；波形蛋白、TGF-β1、p-smad3、smad7一抗购买于美国Santa Cruz公司；二抗购于中国Proteintech公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.2实验动物伦理 本方案经遵义医学院动物实验伦理会审查，遵循动物福利和伦理原则，审查编号伦审〔2016〕2-067号。

1.3乳鼠CFs的培养及鉴定 3天龄乳鼠无菌条件下于超净台上开胸取出心脏，剔除心脏结缔组织，留取心尖部并剪碎〔19〕，0.125%胰酶消化20 min，终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清，再用0.75 mg/ml胶原酶Ⅱ于37℃消化2 h，终止消化后再次1 500 r/min离心5 min，弃上清，贴壁培养90 min，弃去尚未贴壁的细胞悬液，加入含10%FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2孵箱中培养，待细胞贴壁后，倒置相差显微镜下观察乳鼠CFs的生长状况。波形蛋白免疫荧光法进行细胞鉴定。选取状态良好的第4代CFs用于后续实验。

1.4CCK-8测高盐对乳鼠CFs增殖的影响并筛选促CFs增殖的最佳Na+浓度和作用时间 胰酶消化乳鼠CFs后，制备(3～5)×104个/ml的细胞悬液，每孔100 μl接种在96孔板中，血清饥饿法同步化24 h后，于DMEM培养基中加入相应NaCl，使培养基中Na+浓度范围在146～176 mmol/L，梯度3 mmol/L，共分11组，培养基中Na+终浓度146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176 mmol/L(对应的NaCl浓度分别为：131.8、134.5、137.1、139.9、142.6、145.3、148.0、150.7、153.4、156.1、158.8 mmol/L)，加入培养基的NaCl分别为：1.39、1.56、1.74、1.92、2.09、2.27、2.44、2.62、2.79、2.97、3.14 mg/ml；对照组培养基Na+终浓度139 mmol/L为培养基中原有浓度，对应的NaCl浓度110 mmol/L。各组分别培养24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入增殖检测液10 μl，37℃孵育3 h，波长450 nm处测定OD值。根据CCK-8结果确定促CFs增殖的最佳Na+浓度和作用时间，进行后续实验。

1.5CCK-8增殖试剂盒检测渗透压对乳鼠CFs增殖的影响 CFs接种数量及同步化同1.4，根据1.4结果分为对照组(培养基Na+终浓度139 mmol/L)、高盐组(培养基Na+终浓度161 mmol/L)、甘露醇组(甘露醇浓度为29.334 mg/ml，与高盐组等渗，渗透压为355.55 mOsm/kg)，培养48 h，每孔加入细胞增殖检测液10 μl，37℃孵育3 h，波长450 nm处测定OD值。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测高盐对乳鼠CFs中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响 乳鼠CFs以5×105个/ml的密度接种于培养瓶中，同步化及分组同1.5，培养48 h后收集细胞培养上清液，按照酶联免疫检测试剂盒说明进行Ⅰ型及Ⅲ型胶原的测定。

1.7Western印迹检测高盐对乳鼠CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达的影响 细胞以5×105个/ml接种于培养瓶中，同步化及分组同1.5，培养48 h后收集细胞，总蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法行蛋白定量。十二烷基硫代硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行电泳，电转到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，4℃孵育TGF-β1、p-smad3、smad7一抗过夜；TBST洗膜，室温孵育二抗1 h，TBST洗膜，将ECL化学发光试剂加在膜表面后，经Bio-Rad凝胶成像仪采集图像，采用Quantity One定量分析软件进行积分吸光度测定，目的蛋白的积分吸光度值除以内参照GAPDH的积分吸光度值，得到各组蛋白条带相对值。

1.8统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1乳鼠CFs的生长形态及鉴定 CFs在培养60 min后大多数已贴壁，伸展成梭形，多边形，乳鼠CFs生长迅速，2～3 d即可进行传代培养，传代后CFs铺满培养瓶底，平行排列呈峰、谷样结构特征(图1)。波形蛋白单克隆抗体免疫荧光鉴定〔17〕结果显示乳鼠CFs胞质着绿色荧光，4′,6-二脒基-2-苯基嘴哚(DAPI)复染胞核着蓝色荧光，合并图后胞核清晰可见，见图2。

图1 倒置相差显微镜观察乳鼠CFs的生长状态和生长形态(×100)

图2 乳鼠CFs 波形蛋白免疫荧光染色(×400)

2.2高盐诱导乳鼠CFs增殖的时效量效关系及促CFs增殖的最佳Na+浓度和作用时间 CCK-8结果显示，与对照组(培养基Na+终浓度139 mmol/L)比较，培养基Na+终浓度146～176 mmol/L作用48、72 h OD值显著增高，其中培养基Na+终浓度161 mmol/L作用48 h时CFs增殖效应最为明显，培养基Na+终浓度146～176 mmol/L 培养96 h OD值降低。由此确定，高盐诱导乳鼠CFs增殖的最佳Na+终浓度为161 mmol/L，适宜的作用时间为48 h。见表1。

2.3渗透压对乳鼠CFs增殖的影响 选择促乳鼠CFs增殖最为显著的培养基Na+终浓度161 mmol/L为高盐组作用48 h后，高盐组细胞OD值为1.214±0.154，细胞活性较对照组(OD值为0.857±0.064)和甘露醇组(OD值为0.906±0.119)显著增高(均P<0.05)，甘露醇组细胞活性与对照组比较未见明显变化(P>0.05)。可见，高盐组与甘露醇组虽为等渗，但对细胞增殖的影响却是不同的，高盐组促进了细胞增殖，但甘露醇组对细胞增殖无影响。

表1 高盐对乳鼠CFs增殖的影响

与对照组比较：1)P<0.05

2.4高盐对大鼠CFs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分泌的影响 高盐(培养基Na+终浓度161 mmol/L)作用48 h后，高盐组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分泌较对照组和甘露醇组显著增多(P<0.05)，甘露醇组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分泌与对照组比较无差异(P>0.05)。见表2。

表2 高盐对乳鼠CFs胶原分泌的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与高盐组比较：2)P<0.05；下表同

2.5高盐对大鼠CFs 中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达的影响 高盐组TGF-β1和p-smad3蛋白表达较对照组和甘露醇组显著增多(P<0.05)，smad7蛋白表达显著减少(P<0.05)；甘露醇组TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达与对照组比较无差异(P>0.05)。见表3、图3。

表3 高盐对乳鼠CFs TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达的影响

图3 高盐对乳鼠CFs TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达的影响

3 讨 论

MF是指单位质量细胞外基质(ECM)中胶原含量或胶原容积分数明显高于正常值及成纤维细胞增殖的病理表现，它与高血压、心功能不全、心律失常等疾病密切相关〔20〕。ECM由胶原、弹性蛋白、纤维蛋白及蛋白聚糖等组成，其主要成分是胶原蛋白，且以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原为主，二者为参与MF的胶原蛋白类型〔21〕。CFs是心脏组织的主要组成细胞，CFs主要合成的胶原类型为Ⅰ型和Ⅲ型胶原〔13〕。正常生理情况下，成纤维细胞少量分泌胶原蛋白，维持心脏的结构和功能，当受到外界病理因素刺激时，CFs处于激活状态，重新增殖，并转化成肌成纤维细胞，进而介导胶原蛋白过度沉积，导致MF发生〔22〕。

食盐与高血压的关系一直为人们所重视，高盐饮食诱导高血压及其靶器官损害的防治仍是重要的临床课题。近年研究发现，高盐饮食可诱导高血压大鼠和正常血压大鼠心血管纤维化〔6〕。另有体外实验证实，高钠盐培养液能引起血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、蛋白合成增加〔23〕，但高钠盐培养是否会影响CFs增殖和胶原分泌少见报道。本实验通过模拟体外高盐环境，观察到当盐浓度到达一定程度时会发生成纤维细胞增殖，另一方面，同样的培养基Na+终浓度范围，当培养时间延长至96 h时，OD值降低，表明细胞的死亡可能与时间的延长及浓度的增加有关，这样的结果又会与各种心血管疾病的发生相关联，故在后续实验中选择培养基Na+终浓度161 mmol/L作为高盐组进行相关指标检测。Na+是细胞外液中的主要阳离子，在维持细胞外液晶体渗透压中的作用不容小觑，本实验说明高盐组与甘露醇组虽为等渗，但对细胞增殖的影响却是不同的，高盐促进了细胞增殖，与培养基中Na+浓度增加有关，并非是高盐所致的渗透压增高影响了细胞的增殖。课题组前期整体动物实验结果显示，长期给予Wistar大鼠8%高盐饮食后，发现大鼠血管周围和心脏间质发生了明显的纤维化Masson染色显示大鼠左心室胶原合成增加〔5〕。本实验结果说明胶原分泌的增加与培养基中Na+浓度增加有关，与高盐所致高渗透压无关。

TGF-β1是强有力的促纤维化的细胞因子〔24〕，参与ECM的合成。TGF-β1 有3种亚型，分别是Ⅰ型(TβR-Ⅰ) 、Ⅱ型(TβR-Ⅱ) 和Ⅲ型(TβR-Ⅲ) ，其中 TβR-Ⅲ是由二硫键链接的蛋白聚糖，含量最多，与 TGF-β1 结合后，可将 TGF-β1 传递给TβR-Ⅰ或者 TβR-Ⅱ。活化后的TβR-Ⅰ则调控下游smad2/3磷酸化，磷酸化smad2/3与smad4 结合形成活性的转录复合产物共同进入细胞核内，调节相应的靶基因转录，刺激成纤维细胞转化为肌成纤维细胞从而导致器官纤维化的发生与发展〔25〕。本实验说明渗透压相等的高盐组与甘露醇组，对CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达的影响不同，高盐导致CFs中TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达异常，仅仅与培养基中Na+浓度增加相关。 综上所述，高盐能够诱导大鼠CFs发生增殖，当Na+浓度161 mmol/L，作用48 h时CFs增殖效应最为显著。高盐可诱导CFs发生增殖以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌增加，与培养基中Na+浓度增加有关，并非是高盐所致的渗透压增高影响了细胞的增殖及胶原分泌，其机制可能与培养基中Na+浓度增加导致TGF-β1、p-smad3、smad7蛋白表达异常有关。