丁苯酞通过诱导自噬调控BV-2小胶质细胞炎症反应

2020-01-09郭利晴张慧予李慧源孙晓红

中国医科大学学报 2020年1期

郭利晴，张慧予，李慧源，孙晓红

（中国医科大学附属第四医院神经内科，沈阳 110032）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种起病隐匿，病程呈进行性进展的神经退行性疾病，认知障碍和行为损害是其主要特征，病理变化包括β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积、神经原纤维缠结和神经元变性［1］。近年来的研究［2］认为脑内促炎症介质的过度释放加重了中枢神经系统损伤，减轻中枢神经系统炎症反应有助于改善记忆和认知能力。丁苯酞（butylphthalide，NBP）是一种广泛用于治疗脑血管疾病的药物，在脑卒中模型中可以减少血脑屏障损伤，研究［3-4］发现NBP可以改善脑梗死的炎症反应，但是对Aβ25-35诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应的调节及相关机制尚不清楚。本研究拟利用Aβ25-35激活BV-2小胶质细胞构建AD炎症细胞模型，并在给予NBP干预后检测相关的炎症和自噬指标，探讨NBP对炎症的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

BV-2小胶质细胞（中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心），胎牛血清（德国Sera Pro公司），细胞培养基DMEM/HIGH GLUCOSE（美国HyClone公司），纯度＞99%的NBP粉末、纯度＞99%的Aβ25-35（美国APExBIO公司），BCA蛋白定量试剂盒（中国万类生物科技公司），ECL化学发光试剂盒（中国碧云天生物技术公司），ELISA试剂盒（美国R&D公司），LC3B和p62抗体（美国Proteintech公司），Beclin1、ATG5、白细胞介素（interlukin，IL）-6和IL-1β引物（武汉生工公司），实时PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），实时PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组：BV-2小胶质细胞培养于含有90%DMEM/HIGH GLUCOSE培养基和10%胎牛血清的培养基，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，1～2 d后进行消化混悬，按1 ∶2或1 ∶3的比例传代。将同时段培养处于对数生长期的细胞分为Control组（培养基培养细胞24 h）、Model组（20 μmol/L Aβ25-35处理细胞24 h）、NBP组（40 μmol/L NBP预处理2 h，20 μmol/L Aβ25-35继续处理细胞24 h）和NBP联合6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）组（0.5 mmol/L 3-MA和40 μmol/L NBP依次预处理2 h，20 μmol/L Aβ25-35继续处理细胞24 h）。

1.2.2 CCK-8法检测NBP和Aβ25-35对BV-2小胶质细胞活力的影响：将生长良好的细胞混悬接种到96孔板，100 μL/孔，约5×103个细胞。培养箱培养24 h后，对各组细胞分别进行处理及培养后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱孵育1 h，酶标仪测定各孔吸光值，计算细胞存活率。

1.2.3 Western blotting：干预结束后，弃培养基，PBS清洗细胞3遍；提取总蛋白，BCA蛋白定量，行SDSPAGE电泳（浓缩胶80 V、30 min，分离胶110 V、60 min）；转移蛋白至已被甲醇激活的聚二偏乙烯膜（80 V、90 min）；5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜（5 min/次×3次）；加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜（10 min/次×3次）；加入二抗孵育1 h，TBST洗膜（5 min/次×3次）；ECL发光显色。重复实验3次，应用Image J软件分析目的条带和内参β-actin的灰度值，用二者之比表示目的蛋白的相对表达情况。

1.2.4 实时PCR：Trizol法提取细胞总RNA，用反转录试剂盒获取cDNA，用PCR试剂盒以cDNA为模板进行扩增，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，GAPDH作为内参基因，2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.2.5 ELISA：收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明检测上清液中IL-1β的分泌量，450 nm读板，制作标准曲线，根据标准曲线计算各孔IL-1β的含量，实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NBP和Aβ25-35对BV-2小胶质细胞活力的影响

利用CCK-8法检测NBP和Aβ25-35对BV-2小胶质细胞生存率的影响，将NBP浓度梯度依次设为0、10、20、40、60 μmol/L，Aβ25-35浓度梯度设为0、10、20、40 μmol/L。结果显示，NBP浓度≤40 μmol/L时，细胞活力无明显变化，因此后续实验选取40 μmol/L作为干预细胞的终浓度；Aβ25-35浓度为10 μmol/L时细胞仅轻微受损，与未处理细胞相比无统计学差异，细胞损伤随Aβ25-35浓度的增加而逐渐加重，故选择20 μmol/L作为细胞造模的有效处理浓度。见图1。

2.2 NBP对BV-2小胶质细胞自噬效应的调控

Western blotting和实时PCR结果显示，与Model组相比，NBP组自噬蛋白LC3B-Ⅱ和自噬基因ATG5、Beclin1表达增加，p62蛋白表达减少，自噬水平上调。给予自噬抑制剂3-MA联合处理后，3-MA组自噬水平较NBP组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 NBP对BV-2小胶质细胞炎症反应的作用

Aβ25-35诱导BV-2小胶质细胞后，实时PCR检测发现Model组炎性细胞因子IL-1β、IL-6基因表达较Control组增加，ELISA结果显示细胞上清液中IL-1β含量明显升高。与Model组相比，NBP组IL-1β、IL-6mRNA和细胞上清液中IL-1β的表达显著降低。3-MA组IL-1β、IL-6mRNA和细胞上清液中IL-1β水平较NBP组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图1 梯度浓度的NBP和Aβ25-35对BV-2小胶质细胞存活率的影响Fig.1 Effect of concentration gradients of NBP and Aβ25-35on the viability of BV-2 microglial cells

图2 Western blotting和实时PCR检测自噬相关指标的表达情况Fig.2 Results of autophagy related indicators as detected by Western blotting and real-time PCR

3 讨论

AD发病机制复杂，慢性炎症反应是其众多机制假说中研究较为广泛的一种。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，具有多种生物学功能，是介导中枢神经系统炎症反应的重要细胞，生理状态下呈静息态，当受到毒性物质和病原体等病理因素刺激时，转变为激活态。AD时具有神经毒性的Aβ异常沉积，可招募小胶质细胞迁移至其周围而被激活，持续释放促炎症介质IL-1β、IL-6等细胞毒性物质，破坏周围的神经元和突触，使其丧失正常的生理功能，逐渐进展为中枢神经系统慢性炎症损伤［5-8］。小胶质细胞及其介导的神经炎症反应在AD的病理过程中具有重要作用。

自噬是细胞内聚集蛋白质和受损细胞器等病变的清除降解方式，在维持细胞生存、更新和宿主防御等方面发挥关键作用。自噬障碍与神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病等多种病变的病理变化相关［9］。越来越多的证据表明自噬参与炎症反应的调控，自噬受损时炎症反应加重。研究［10-12］认为，自噬可能通过清除聚集的炎性体，抑制其活化，进而阻碍某些促炎症介质的释放。因此，深入探讨两者之间的作用机制具有重要意义。

NBP是一种提取自芹菜的脂溶性物质，具有抗凋亡、抗氧化应激、改善线粒体功能和增强认知能力等多种神经保护作用［13］。本研究利用NBP干预Aβ25-35构建的BV-2小胶质细胞炎症模型，通过Western blotting、ELISA和实时PCR技术分别检测各组细胞的炎症指标IL-1β、IL-6和自噬指标ATG5、LC3B-Ⅱ、Beclin1及p62的变化，探究NBP与炎症之间的作用机制。p62亦称为sequestosome-1（SQSTM1），是一种自噬受体，介导泛素化底物的降解，自噬效应增加时LC3B-Ⅰ脂化转变成LC3B-Ⅱ并定位于自噬泡膜上，泛素化底物与p62特定区域结合后迁移至LC3B-Ⅱ位点，与之相互作用形成闭合的自噬体，自噬体吞噬p62及其介导的泛素化底物后与溶酶体融合，并在溶酶体酶的作用下降解清除p62和底物。自噬相关物质ATG5和Beclin1的表达在自噬体形成过程中亦发挥关键作用，是衡量自噬水平的重要指标［14-16］。本研究结果显示，Aβ25-35可以活化BV-2小胶质细胞，炎性细胞因子IL-1β、IL-6表达增加，而NBP具有上调自噬、减轻炎症反应的作用，说明自噬与炎症之间确实存在某种联系。为了验证这种关联，本研究中设置了自噬抑制剂3-MA组，结果显示，3-MA组在自噬水平受到抑制的同时，炎性细胞因子IL-1β、IL-6表达增加。以上结果表明，NBP可能通过诱导自噬参与抗炎过程，但其具体的调控机制尚不清楚，有待深入探讨研究。