李雅欣 刘加强

糖尿病(diabetes mellitus，DM)[1]是一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，可导致骨骼系统紊乱、血管并发症和组织愈合延迟等多种问题。其中β 细胞被破坏，胰岛素绝对缺乏为1 型糖尿病(T1DM)，胰岛素抵抗伴胰岛素相对不足，或胰岛素分泌缺陷为2 型糖尿病(T2DM)。口腔疾病与糖尿病之间的联系复杂多样，如牙周炎[2]，列糖尿病的并发症第六位，表现为牙周支持组织不可逆损伤、牙槽骨吸收和牙齿脱落。此外，糖尿病患者种植体周围炎的患病率同样增高，种植体骨整合过程中的骨-种植体愈合均延迟，特别是愈合期间在骨钛界面处发生的成骨细胞生物学功能下降[3]。口腔临床中常见因肿瘤、牙周病、发育畸形和外伤等因素所致的颜面骨组织缺损，而糖尿病可诱发全身糖尿病性骨质疏松(diabetic osteoporosis，DOP)，患者骨量减少，骨组织显微结构受损，骨脆性增加，骨折愈合和骨缺损修复功能受损，身心健康受到严重影响。

上述临床问题与糖尿病环境下的骨形成的细胞学机制密切相关，目前体内研究主要是通过建立啮齿动物的糖尿病模型来实现，其中1 型糖尿病的实验模型大多通过注射链脲佐菌素(STZ)诱导胰岛β细胞损伤来建立，2 型糖尿病的模型通常将小鼠暴露于高脂饮食和注射中等剂量的STZ 而建立。体内研究大多涉及潜在治疗药物选择或者材料改进问题，结果表明了糖尿病的整体负面作用，更多的研究聚焦体外模拟糖尿病环境下具体细胞生物学特性的改变及相关信号通路。最常用的方法为高糖培养，考虑到糖尿病患者体内复杂微环境，也有少许研究通过添加糖尿病动物模型来源的血清进行细胞培养。本文将针对糖尿病对骨生成的细胞生物学机制进展作一综述，重点阐述体外实验下高糖刺激对具体细胞的多种影响和相关分子机制。

1.高糖环境对间充质干细胞的影响

间充质干细胞拥有自我更新及多向分化的潜能，是骨组织再生的重要种子细胞。在体外特定诱导下，可向成骨细胞、网状细胞等多种的细胞谱系分化，其中成骨、成血管和成脂分化的调控对于维持骨稳态十分重要。

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞方向分化，是骨生成的关键，影响种植体骨结合以及颌骨缺损修复。与正常人牙槽骨来源的BMSCs 相较，糖尿病患者的BMSCs增殖能力受抑，凋亡率增高[4]。同时，高糖压力下骨髓间充质干细胞表现出早衰倾向，衰老相关炎性细胞因子IL-6 等分泌增多，BMSCs 可能是通过自噬介导的衰老来避免凋亡以保持细胞存活。高糖诱导下的BMSCs 功能障碍还体现在其成骨分化受抑，Runx2、osterix 和β-catenin 等相关转录因子表达降低，成骨细胞及其前体基质矿化的重要标志碱性磷酸酶ALP 活性下降，Jiang 等用Sonic hedgehog(Shh)慢病毒载体转导的BMSCs 细胞中，HG 对BMSCs 成骨分化的抑制作用被逆转，证明了高糖刺激影响了BMSCs 的Shh 信号通路[5]。同时氧化应激反应增强，大量的ROS 损伤血管内皮细胞，干细胞的成血管能力也有所下降，而成脂分化受诱导增强。

除了骨髓间充质干细胞外，也有少许研究聚焦糖尿病性牙周炎患者的牙槽骨重塑的关键细胞——牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，体外高糖压力下引起PDLSCs 的氧化应激反应，其增殖和成骨能力受抑，上调细胞自噬能力和加入抗氧化剂如促红细胞生成素可部分恢复其成骨能力[6，7]，miR-31 抑制剂也可在mRNA 和蛋白质水平上促进矿化骨基质的形成并增强Runx2和OCN 表达[8]。因此，改善高糖状态下的自体干细胞成骨及成血管活性，扭转其功能受限局面成为临床关键问题。

2.高糖环境对成骨-破骨动态平衡的影响

2.1 高糖环境对成骨细胞的影响 成骨细胞(osteoblast，OB)是参与骨形成的主要功能细胞之一，在骨骼生长发育及骨量维持方面扮演着关键角色。大多数研究表明，OB 暴露在高糖环境中，其增殖能力降低，细胞外基质合成不良，后续成熟及矿化均受到影响，不利于骨形成及骨量的维持。最近体外实验证明，高糖环境可通过焦磷酸化途径即caspase-1/ GSDMD/ IL-1β 途径激活细胞凋亡，抑制牙槽骨中成骨细胞的增殖和分化[9]。

经典的Wnt/ β-catenin 途径是成骨细胞功能和骨形成的重要调节剂，高糖刺激可以靶向经典Wnt 通路的不同成分使信号转导途径受抑。最新研究发现[10]，与Wnt 通路相关的半乳糖凝集素-3(GAL-3)，可在循环中结合和降解晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)，骨细胞分泌包含miR-124-3p，GAL-3 和IL-6 的外泌体，后被成骨细胞内吞。高糖条件下，外泌体内miR-124-3p 含量增加，靶向抑制成骨细胞中的Gal-3 的表达，导致Runx2 表达下降和IL-6 含量增加。除Wnt 通路外，Li 等[11]在探究能量稳态和骨骼重塑是否通过Hippo 信号通路相关联时发现，高糖可抑制成骨细胞中Hippo 通路上游核心成分Mst1/ 2Mst1/ 2 激酶的活性，后续成骨细胞中主要的葡萄糖转运蛋白Glut1 表达下降，AMPK被激活，Runx2 泛素化降解，成骨细胞分化和骨形成受抑，且Mst1/ 2 激酶对Glut1 表达的调节独立于Yap/ Taz 表达。

高糖改变生物矿化的过程，抑制成骨细胞的矿化和成骨标记物(ALP、Runx2、I 型胶原、OCN)的表达，并促进脂肪生成标记物(PPARγ、aP2、抵抗素)的表达，具体机制尚不清楚。有研究认为，25.5mmol/ L 高糖可能会降低成骨细胞MC3T3-E1中的雌激素或雌激素受体ERα 信号传导从而抑制骨形成，连同其诱导产生的ROS 共同抑制PI3K/Akt 和β-catenin 信号通路，来促进成骨细胞的成脂作用[12]。但是，A.García-Hernández 等[13]发现用浓度为24mmol/ L 的葡萄糖(正常葡萄糖浓度为5.5mM)孵育成骨细胞时，骨唾液蛋白(BSP)、骨钙蛋白(OCN)和转录因子Runx2 的表达增加。在其他细胞如人牙周膜成纤维细胞中，高糖刺激也增强了细胞矿化作用[14]，对于上述两种相反结论，可能与成骨细胞及其前体细胞对高糖环境的反应性与细胞来源、培养类型(原带培养、传代培养、或细胞系)以及成骨分化阶段等因素有关。但一致结论是，过量的葡萄糖导致成骨细胞ALP 活性下降，导致钙与磷酸盐沉积的不平衡，最终形成质量不佳的矿物质。

有学者认为，单一高糖培养不能模拟体内复杂糖尿病环境，因此研究成骨细胞在糖尿病环境中的功能活性变化，往往与炎性细胞因子和氧化应激相结合。在体外高浓度葡萄糖处理的成骨样MG-63细胞中，mRNA 和蛋白水平上都可以检测到肿瘤坏死因子(TNF)-α 表达增加，与体内结果一致。单独用TNF-α 于刺激高糖条件的成骨细胞时发现，其与高糖协同降低细胞活力，促进细胞凋亡[15]。高糖环境下成骨细胞内线粒体和细胞质中的ROS 升高，其增殖，成骨分化和矿化能力降低[16]。体外实验也可加入过氧化氢常模拟糖尿病的氧化环境，结果一致。针对此，一些抗氧化剂如α-硫辛酸可维持线粒体稳态来调节在高糖诱导下氧化应激状态的成骨细胞分化。胰岛素也被证实可通过上调一氧化氮/ 环GMP/ cGMP 依赖性蛋白激酶(NO/ cGMP/PKG)转导信号，降低炎性因子含量和氧化应激水平，来促进高糖环境下成骨细胞增殖、分化和存活[17]。了解高糖对成骨细胞分化和基质矿化沉积作用的潜在机制，可能为未来糖尿病相关的骨流失修复的治疗和预防方法提供新的见解。

2.2 高糖环境对破骨细胞前体及破骨细胞的影响 颌骨是人体骨组织代谢中最为活跃的部分，时刻不断地进行更新和改建，除了骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞引导骨生成，也伴随由造血细胞来源的破骨细胞(Osteoclast，OC)主导的骨吸收。体外实验常用小鼠巨噬细胞Raw264.7 细胞系或骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophage，BMM)来研究破骨细胞的分化。糖尿病环境中破骨细胞形成和分化结果似乎是矛盾且争议的，其中的机制更为模糊与复杂。

一些人体研究表明，T2DM 患者血清中的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平升高，这是破骨细胞活性增加的指标，表明破骨细胞功能增强。动物研究还表明，在T1DM 和T2DM 糖尿病小鼠模型中，破骨细胞的活性和形成量大大增加，导致骨吸收能力提高。而大部分细胞实验认为高糖可通过降低ROS产生、caspase-3 和NF-κB 活化来干扰RANKL信号传导，来直接或间接抑制破骨细胞的分化和功能。如Dong W 等认为高糖(16.5mmol/ L)促进AMPK 的表达来抑制破骨细胞分化和骨吸收[18]。Cai 等[19]将破骨细胞暴露于低葡萄糖(5.5mmol/ L)中发现AMPK/ mTOR/ ULK1 信号轴上调且激活自噬，证实高葡萄糖以剂量依赖的方式抑制破骨细胞的形成和功能，但不影响RAW264.7 细胞的增殖。但也存在少许相反结果，如An Y 等[20]人发现高糖(35 mmol/ L)可以显著激活OC 中MAPK、NF-κB 以及NLRP3 炎性体相关蛋白的表达，诱导增强了破骨细胞的骨吸收能力，且抑制了细胞胞吞作用，而这种现象可被胰岛素所逆转，体外实验差异结果可能与细胞谱系的异质性和葡萄糖浓度等孵育条件之间的差别有关。

考虑到糖尿病患者和动物体内除血糖外，以棕榈酸为主要成分的游离脂肪酸(FFA)水平也有明显增加，Qu B 等联合高糖刺激和棕榈酸酯(PA)的组合模拟T2DM 微环境，结果表明高糖和FFA 的组合利于破骨细胞的分化，不仅TRAP 阳性多核细胞的数量增加，而且RANK 和RANKL 的表达同样增强，而OPG 表达水平降低[21]。

2.3 高糖环境对成骨-破骨细胞系统的影响为了维持相对稳定的骨骼体积和质量，通过细胞谱系之间及内部的通讯，成骨细胞和破骨细胞的功能受到严格调节。破骨细胞的形成和分化主要受成骨细胞分泌的细胞外RANK/ OPG/ RANKL 系统调节，OPG/ RANKL 的比率降低会促进破骨细胞分化。高糖(16.7mmol/ L)主要影响成骨细胞中OPG的表达，而不是RANKL。Cunha JS 的实验[22]也证明了在30mmol/ L 的高葡萄糖诱导条件下，成骨细胞的RANKL mRNA 水平增加了2 倍，而OPG 的mRNA 水平增加了30 倍，RANKL 的量相对于OPG 不值一提，预估其无法与破骨细胞中的RANK结合，造成骨吸收减少，新的成骨细胞的募集受限，骨重塑的动态循环不良，进而导致骨质疏松，文章认为这可能解释了无动力型骨病的发病机理。

除RANK/ OPG/ RANKL 调节系统外，破骨细胞和成骨细胞的分化也受EphB4/ EphrinB2 分子机制调控，成骨细胞中的EphB4 分子增强成骨细胞分化，破骨细胞前体中的EphrinB2 分子抑制破骨细胞分化，Wu Min 等[23]在体外和体内实验中也证明了高糖导致EphB4/ EphrinB2 的表达失调。除此之外，高糖环境也可通过影响骨细胞-破骨细胞通讯来干扰骨骼代谢，Maycas M 等[24]在比较高糖对小鼠骨样MLO-Y4 细胞和成骨细胞系MC3T3-E1 这两种细胞系与破骨细胞前体RAW 264.7 相互作用的影响时发现，预先暴露于高糖环境下的的MLO-Y4 细胞条件培养基(CM)中RAW 264.7 细胞迁移受抑，而同样条件的MC3T3-E1 细胞CM的影响并不明显，前者形成了对羟磷灰石的吸收活性很小的破骨细胞样细胞。

3.糖尿病血清培养下的骨生成细胞研究

选用糖尿病血清还是单一高糖刺激一直存有争议，理论上糖尿病血清是最接近体内环境的刺激物，其不仅包含高葡萄糖，还附加真实病理刺激，如高脂和炎性细胞因子。但目前相关研究较少，多集中在改善糖尿病患者的种植体骨结合时成骨细胞活性的生物材料领域，如Ma 等[25]在多孔钛合金植入物表面进行培养成骨细胞发现，加入糖尿病血清后产生过量ROS 损害成骨细胞粘附力，同时成骨分化中起着至关重要的BMP-2 信号通路受抑，后续ALP 活性，骨钙素生成和基质矿化相应减弱，也可能与ROS 介导的PI3K/ AKT 途径受抑有关[26]。整体看来，添加糖尿病血清研究与广泛采用的高糖或联合其他炎性细胞因子等成分刺激体外研究结论基本一致，但糖尿病血清的具体成分质和量均难确定，是否存在不同供体来源血清异质性问题，这仍然值得思考。

4.展望

糖尿病患病率居高不下，患者体内长期糖尿病环境通过影响骨生成过程中相关细胞的增殖、迁移、分化、凋亡等各种功能，导致牙周炎严重骨流失，种植体的骨结合受阻，颌骨等骨质疏松及骨折发生的风险加大，阻碍颜面颌骨骨折愈合和骨缺损修复。糖尿病环境十分复杂，高糖刺激、氧化应激和炎性细胞因子的协同作用不可忽视，大量体内实验和体外实验均证明了高糖环境的负面作用并猜测了相关分子机制，也存在一些疑虑矛盾问题和结果需要思考。本文回顾了近几年来糖尿病环境对骨生成的细胞生物学机制，阐述了相对矛盾的实验结果及其细胞来源、高糖浓度、以及培育条件，希望为广大科研工作者提供信号通路灵感和实验设计建议。最重要的是，依据细胞实验推断出的潜在治疗靶点或方式，是否能在临床治疗的不同阶段扭转糖尿病患者体内骨生成的不利局面，尚需要进行更多体内实验和临床试验来评测，比如选择何种适宜的细胞调控因子，如何将药物或者调控因子高效结合新型复合材料，或者修饰或改变材料的表面形貌。同时鼓励更换思路开发耐受糖尿病环境的骨结合、骨修复新药新材料，从而提供一个最佳微环境，最大化地激发其骨形成相关细胞的潜能，更好地服务于临床，缓解糖尿病患者的身心痛苦。