何芝菲

（重庆市潼南区疾病预防控制中心，重庆402660）

氯氰菊酯是一种拟除虫菊酯类杀虫剂，其杀虫活性较高，对光和热均比较稳定，广泛用于蔬菜、水果的杀虫[1]。氯氰菊酯在环境中的半衰期长，在自然条件下难以快速降解。因此大量长期使用，必然会造成蔬菜、水果中氯氰菊酯残留较高的情况[2]。尽管氯氰菊酯毒性相对较低，但食用残留量较高的食品后会对人们的身体健康带来巨大的威胁。近年来，随着我国与西方国家农产品进出口贸易的发展，一些西方国家调整了农产品中农药残留的标准，造成我国农产品出口的标准更加严格。为解决这一问题，急需寻求一种安全有效的途径来降解农产品中农药的残留[3]。

利用微生物来降解土壤中的农药是一种最主要、最彻底的净化方式。而对农药有降解作用的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等[4]。枯草芽孢杆菌就具有降解能力，因此利用枯草芽孢杆菌降解土壤中农药技术研究具有十分重要的意义。生物修复方法是指利用生物本身或生物产品来降解污染物，此方法具有无毒、无残留等优点，其使用成本较低，且能有效消除农药残留或者降低残留农药毒性[5]。以生物修复（Bioremediation）为理论基础的农药残留降解菌技术应运而生，该技术高效、无毒、无二次污染，而且经济实用，操作简单，是一种降解农药的重要方法[6]，目前国内外已有相关研究报道。

本实验拟采用高效液相色谱法测定1株分离自重庆市潼南区某果园的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，编号A-1）对氯氰菊酯的降解率，为该菌的进一步研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

A-1，分离自重庆市潼南区某果园的1株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），初筛表现出对氯氰菊酯有一定降解作用，现由重庆市潼南区疾病预防控制中心微生物实验室保存。

1.2 主要仪器及试剂

LC-10A2010C HT液相色谱仪（日本岛津公司），附LC-solution工作站（日本岛津公司）；Satorius CP225D型电子天平（德国塞多利斯公司）；SORVALL pico型高速离心机（美国ABI公司）；Mill-Q超纯水仪等（德国密理博公司）。

正己烷(华大)、丙酮(华大)、二氯甲烷(华大)、乙腈（TEDIA）、甲醇（TEDIA）等

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

将A-1划线于（含氯氰菊酯100 mg/L）LB斜面，30 ℃培养24 h后，用无菌生理盐水洗下并调整细胞浓度约为108个/mL，制成种子液。

将A-1种子液接种于100 mg/L氯氰菊酯的LB培养基中，接种量5%，分装于30 mL/瓶。同时接种5%无菌水为空白对照，30 ℃、180 r/min培养120 h，测定A-1对氯氰菊酯的降解情况。

1.3.2 氯氰菊酯的提取与降解率测定

取1 mL均匀培养液，加入1 mL乙腈，超声波破碎30 min，用乙腈定容至10 mL，于13 000r /min离心10 min，将上清液用0.45μm的有机相滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液供液相色谱分析用。测定条件：色谱柱为Gemini 100Å C18柱（5.0 μm，150 mm×4.60 mm）；流动相为乙腈-水（76∶24，v/v），流速1.0 mL/min；紫外检测器波长为210 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2 结果与分析

A-1在1.3.1条件下经120 h培养，除去对照组氯氰菊酯的损失部分，采用归一法进行计算，实验结果得出空白对照中农药含量为7.24%，样品液中残留农药含量为5.05%。依据降解率计算公式得出实验组中30.25%氯氰菊酯被A-1降解（图1）。说明此株菌对氯氰菊酯具有降解能力，A-1对氯氰菊酯降解率为30.25%。

3 结论与讨论

图1 A-1的氯氰菊酯的液相色谱图

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）可降解的农药类型较多，如有机磷、有机氯等杀虫剂、甲磺隆等除草剂。但是国内对于枯草芽孢杆菌对氯氰菊酯的研究较少，因此还有很大的后续研究空间。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中具有较大应用潜力的菌种之一，枯草芽孢杆菌可作为微生物农药，在抑制植物病原菌生物防治领域也有良好的作用。枯草芽孢杆菌作为植物生防细菌之一，具有较强的防病作用。虽然A-1已被证实对氯氰菊酯具有一定的降解的能力，但要将其用于制备微生物制剂还必须对其进行一系列的生理学特征的鉴定以及其他相关研究。除此之外，还应对A-1用小白鼠进行毒性实验，从而保证安全性。

如果经过以上各项试验后，表现出良好的降解能力且无毒，则可以考虑将其作为微生态制剂的候选菌种开发。随着微生态制剂的发展及其研究的不断深入，将来多种微生物复合的微生态制剂研究将向高技术、高产量、高质量方向发展，具有广泛的市场空间。目前对于枯草芽孢杆菌降解氯氰菊酯的报道较少，对此的研究还远远不够。本实验中的菌株可以进行动物毒理学实验，进一步研究该菌株是否为益生菌，如何将枯草芽孢杆菌制成生物制剂并广泛应用，枯草芽孢杆菌中酶提取以及枯草芽孢杆菌在表达系统中的应用等，都是需要在未来进一步研究的问题。