皇甫瑞娟

（宁夏工商职业技术学院能源化工学院，宁夏银川 750021）

冠突散囊菌属于散囊菌目发菌科散囊菌属，是茯砖茶在特定温度、湿度条件下，通过“发花”工艺长成的自然益生菌体，俗称“金花”[1]，是黑茶茯砖茶在“发花”过程中的优势菌之一[2]。茶体表面和砖茶茶体内部大量肉眼可见的金色颗粒，即为“金花”，是冠突散囊菌产生的闭囊壳。“金花”是形成砖茶独特品质和风味的主要因素，也是评价茯砖茶品质好坏的重要指标[3]。经过国内研究者的不断研究，发现“金花”对发酵茶的品质并无影响，反而会分泌淀粉酶及氧化酶，从而催化茶叶中淀粉向单糖的转化过程，同时使得多酚类化合物氧化，让茶汤变得棕红。同时湖南大学刘仲华教授等的研究[4,5]，已经证明砖茶中的“金花”菌具有显著的降糖、减脂功效，并发现了两种特有的活性物质——伏茶素A和伏茶素B，它们能够有效地调节人们的新陈代谢，并在促进降脂、降压、调节血糖等方面有很好的功效。本文运用基础微生物研究的方法，对黑茶中的“金花”菌进行分离纯化后得到纯菌株，为进一步研究冠突散囊菌的生物活性及应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器设备

实验用样品茶为市面上出售的3种品牌（熙牧源茯茶，泾渭茯茶，泾阳茯茶）的黑茶及茯砖茶；试验中用到的仪器有ZDP-150型振荡培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、LDZX-50FB立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、B1-220A双目生物显微镜（麦克奥迪MOTIC）。

1.2 试剂与培养基

马铃薯淀粉培养基（PDA）：马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂10～15 g，水500 mL，中性pH。

普通固体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

滴棉兰染色液：石炭酸10 g，加入乳酸、蒸馏水各10 mL，再加棉蓝染色剂0.22 g。

1.3 菌种分离

取3份样品茶叶分别标记为S1、S2、S3，每份样品各取5 g，放置在盛有玻璃珠和95 mL无菌水的500 mL锥形瓶中，在温度为28 ℃、转速为180 r/min的摇床中恒温震荡培养20 min，取悬浊液为10-1液，并用无菌水进行浓度梯度稀释，得到10-2～10-65个浓度梯度的菌液，每个梯度溶液取200 μL分别涂布于PDA固体培养基平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养。

1.4 菌种纯化

从初次培养的培养皿中选出不同浓度下分离到的菌种，在超净工作台中将选出的培养皿中的单菌落进行挑取，接种到新的PDA培养基中重新划线培养，直至分离出单一菌落。

1.5 菌种鉴定

1.5.1 形态学观察

对从茶汤中分离出的几种不同的微生物做初步的形态学观察。将分离纯化后的菌株取出，在室温下活化复苏24 h后，分别接种于PDA固体培养基平板上，置于28 ℃培养箱中恒温培养，隔天观察菌落的生长状况。

1.5.2 菌种的光学显微镜观察

待接种的菌种生长至菌落直径为1 cm时，取少量菌丝用棉兰染色液染色5 min后于光学显微镜下观察。

2 结果分析

2.1 菌种的分离纯化

经过初期分离，从茶汤中提取出多种形态特征不一的微生物，并记录初次培养7 d后的菌落生长状况。

在初次分离的基础上，选取长势较好的菌落（S1：10-2、10-3、10-4；S2：10-4、10-5；S3：10-4），在超净工作台中将其接种在新的PDA固体培养基平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养5 d，培养后的观察结果记录如表1。

表1 菌落生长状况记录表

2.2 菌落的形态特征

如图1所示，从二次培养的菌落中共分离得到4种不同形态的单一菌落。A为S1-1平板上分布的直径为5～12 mm的圆形菌落，菌落较为致密，中心凸起部分为黄褐色，靠近边缘为金黄色，边缘部分为白色绒毛；B为S1-2平板上分布菌落直径为1～2 mm的小型橙色圆形粘稠状菌落；C为S1-3平板上长出的直径为5 mm的单一乳白色粘稠状圆形菌落；D为S2-2平板上菌落直径为3～5 mm的圆形菌落，菌落较为致密，中心凸起部分为灰绿色，边缘部分为白色绒毛。

图1 二次培养中分离得到的4种不同形态的单一菌落

2.3 菌落的显微特征

将S1-1和S2-2平板上的菌落经染色后用显微镜观察。如图2所示S1-1的分生孢子囊呈扁球形，菌丝较为疏松；S2-2的分生孢子囊壳为圆球形，菌丝较为致密。根据菌落特征及显微特征判断，这两种菌落为冠突散囊菌。

图2 菌落的显微特征

3 讨论

研究发现，黑茶中含有多种人体所需的氨基酸[6-7]，而“金花”的茂盛程度是决定茶品好坏的重要指标[8]。本次实验将分离出的多种菌落进行多次分离纯化培养，通过观察菌株的培养特征和生理生化特征，发现其优势真菌菌落有两种形态，第一种菌落较大、呈现金黄色，成熟菌落中央凸起位置为黄褐色、边缘为白色，菌落较为致密、表面布满绒毛，显微镜下观察菌体为扁球状。另一种菌落较小、呈现绿色，成熟菌落中央凸起位置为深绿色、边缘为白色，菌落致密，布有绒毛。这些菌落特征、显微观察结果与资料[1,9]中的结果相似，判断为冠突散囊菌。后续将继续对这两种菌种进行分子鉴定，并进一步研究其生物活性及应用。