史建俊 李伟伟 王免 李秀秀 庄雪燕

摘要 [目的]黄山贡菊总黄酮（total flavonoids from Huangshan Gongju，HGTF）提取工艺优化和抗氧化活性测定。[方法]以HGTF提取率为指标，采用单因素和正交试验优化超声波协同酶法提取HGTF工艺。通过自由基清除试验评价HGTF的抗氧化活性。[结果]HGTF的最佳提取条件为酶解时间20 min、复合酶质量分数0.1%、纤维素酶和果胶酶配比1∶1、乙醇浓度60%、料液比1∶20（g∶mL）、超声时间40 min、超声功率280 W、超声温度50 ℃，HGTF提取率为2.78%。抗氧化活性试验结果表明，HGTF溶液对DPPH·、·OH和O2·-的清除率较高，分别为90.47%（0.05 mg/mL）、73.44%（0.10 mg/mL）和78.73%（0.10 mg/mL）。[结论]复合酶解后超声波提取HGTF条件温和、提取率高。该研究为HGTF的应用提供参考依据。

关键词 黄山贡菊;总黄酮;超声波协同酶法;抗氧化活性

中图分类号 R284.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）24-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Ultrasonic Assisted Enzymatic Extraction of HGTF and Antioxidant Activity

SHI Jianjun，LI Weiwei，WANG Mian et al （School of Chemistry and Chemical Engineering，Huangshan University，Huangshan，Anhui 245041）

Abstract [Objective] To optimize the extraction process and antioxidant activity of HGTF. [Method] Taking the HGTF yield as index，the extraction process was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment. The oxidation resistance of HGTF was evaluated by scavenging tests for different free radicals. [Result]The optimum extraction conditions were finally determined as follows，enzymolysis time of 20 min，mass fraction of complex enzyme of 0.1%，cellulasepectinase ratio of 1∶1，ethanol concentration of 60%，solidliquid ratio of 1∶20，ultrasonic time of 40 min，ultrasonic power of 280 W，ultrasonic temperature of 50℃，the extraction rate of HGTF was 2.78%.The results of antioxidant activity test showed that the scavenging rate of HGTF solution to DPPH·，·OH and O2·- was high. The clearance rates to DPPH·，·OH and O2·- were 90.94% （0.05 mg/mL），73.44% （0.10 mg/mL） and 78.73% （0.10 mg/mL），respectively. [Conclusion]Ultrasonic extraction of HGTF after complex enzymatic hydrolysis has mild conditions and high extraction rate. This research provides some reference for the further application of HGTF.

Key words Huangshan Gongju;Total flavonoids;Ultrasonic assisted enzymatic extraction;Antioxidant activity

菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）的头状花序。黄山贡菊为中国药典中5种药用菊花之一，具有平肝、明目、清热、解毒等功效[1]，而且菊花属于药食兼用植物。菊花中主要含有黄酮、萜类、挥发油类等化学成分[2]。药理学研究主要集中在抗氧化、抗菌消炎[3]、免疫调节、抗肿瘤[4]、保护心血管[5]、保肝作用[6]等方面，近年来新发现菊花提取物还具有抗癫痫作用[7]、预防干眼[8]、肠道菌群调节[9]的作用。

黄酮類物质是药用菊花发挥药效的主要成分之一。研究表明菊花黄酮也具有抗氧化性[10]、降血脂[11]和抗肿瘤[12-13]等活性。新的研究发现菊花黄酮可以通过α-葡萄糖苷酶和PTP-1B信号途径的双重调节，增加INS-1细胞胰岛素分泌和显著降低空腹血糖水平，从而可以用于糖尿病的治疗[14]。黄酮的提取常用溶剂提取法、微波提取[15]、超声提取等，现今，有些学者改进了提取方法，如采用酶提取法、超临界CO2萃取法[16]、高压水提法[17]、低共熔溶剂提取法[18]等。酶可以使植物细胞壁水解破碎，有利于胞内黄酮类物质的溶出[19]，与传统提取方法相比，环境友好、提取率高。超声波在液体中高频振动而产生空穴作用，加快细胞组织破坏，缩短提取时间，提高黄酮得率[20]。超声波协同酶法结合2种方法的优点，已广泛应用于黄酮提取中。

为进一步开发黄山贡菊的综合利用价值，该研究以黄山贡菊为原料，采用超声波辅助复合酶法进行HGTF的提取条件优化，并通过检测其清除自由基的能力初步研究HGTF的抗氧化活性，旨在为黄山贡菊资源的深加工提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。黄山贡菊（黄山儒香园茶业有限公司）;纤维素酶（南宁庞博生物工程有限公司）;果胶酶（福州飞净生物科技有限公司）;芦丁标准品（国药试剂公司）;DPPH（合肥巴斯夫生物科技有限公司）;水杨酸（天津福晨化学试剂有限公司）;其他试剂均为AR级。

1.1.2 仪器。KQ超声波清洗机（昆山超声仪器公司）;紫外可见分光光度计（北京普析通用公司）;粉碎机（广州晨雕机械公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线。参照文献[21]，芦丁浓度和吸光度线性回归方程为A=14.058C-0.000 6（R2=0.999 4），说明芦丁在0.004～0.052 mg/mL线性关系良好。

1.2.2 HGTF提取率的测定。称取黄山贡菊粉末1.0 g于烧瓶中，加入10 mL蒸馏水，再加入一定量的复合酶。50 ℃水浴锅中保温酶解后，高温灭活，再超声提取，抽滤得到的滤液用40%的乙醇溶液定容到50 mL，得到HGTF溶液，稀释后按“1.2.1”项下的方法，在510 nm处测定吸光度，计算HGTF提取率：

总黄酮得率=C×n×V×10-3W×100%

式中，C为HGTF含量（mg/mL），n为稀释倍数，V为测量体积（mL），W为贡菊质量（g）。

1.2.3 单因素试验。分别考察料液比（A）、超声时间（B）、超声功率（C）、超声温度（D）、乙醇浓度（E）、酶解时间（F）、复合酶配比（G）、复合酶质量分数（H）对HGTF提取率的影响。单因素水平见表1。

1.2.4 正交试验。综合单因素试验中各因素对HGTF提取的影响，选择料液比（A）、超声时间（B）、超声功率（C）和超声温度（D）为考察因素，以HGTF提取率为评价指标，采用正交试验L9（34）优化提取工艺条件。因素与水平见表2。

1.2.5 工艺验证试验。按“1.2.4”得到的最佳提取工艺条件进行提取，根据5次平行试验结果计算HGTF提取率。

1.2.6 HGTF抗氧化活性试验。分别配制浓度为0.005、0.010、0.030、0.050、0.100、0.150、0.200和0.250 mg/mL的HGTF提取液和VC溶液，参考文献[21]的方法，测定对DPPH·、·OH和O2·-的清除能力。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对HGTF提取率的影响。由图1可知，当料液比超过1∶20（g∶mL）后HGTF提取率缓慢降低。其原因可能是加入的溶剂量越大，贡菊细胞内外浓度差越大，溶剂的扩散渗透作用也越强，溶解的黄酮类化合物增多，提取率逐渐升高。但当加入的溶剂量达到一定程度时，黄酮的浸出量达到饱和，而其他杂质的溶出相应增多，从而使提取率逐渐下降。因此适宜料液比为1∶20。

2.1.2 超声时间对HGTF提取率的影响。由图2可知，随着超声时间的延长HGTF提取率先增加后下降。其原因可能是超声处理可有效地破坏贡菊细胞壁，促使细胞内更多的物质溶出，从而使黄酮的提取率升高。但随着时间的延长，较多的杂质也会随之溶出，从而导致HGTF提取率下降。因此适宜的超声时间为40 min。

2.1.3 超声功率对HGTF提取率的影响。由图3可知，随着超声功率的升高，HGTF提取率先显著增大，后又显著降低。其原因是当超声功率逐渐增大时，就会达到其最低空化阈值，其空化作用将细胞破碎，利于胞内组分的浸出;当继续增大超声功率，其空化阈值也随之升高，空化不易产生，且已空化的气泡无充分时间发生爆裂，空化强度减弱[22]。因此适宜的超声功率为280 W。

2.1.4 超声温度对HGTF提取率的影响。由图4可知，当逐渐升高超声温度时，HGTF提取率先显著升高，而后又降低。可能是由于高温破坏了贡菊中黄酮类化合物的结构，并且增加了杂质的溶出量。故超声适宜温度为50 ℃。

2.1.5 乙醇浓度对HGTF提取率的影响。由图5可知，HGTF提取率随着乙醇浓度先增大后减少。说明采用低浓度乙醇时，溶解的黄酮类化合物较少;随着乙醇浓度的增加，传质推动力增大，HGTF溶出增加;但采用60%以上乙醇浓度时，脂溶性杂质的溶出增加，致使HGTF提取率下降。因此乙醇浓度选择60%比较合适。

2.1.6 酶解时间对HGTF提取率的影响。由图6可知，20 min 的时间使复合酶与底物结合并充分反应，发挥其最大的酶解作用，使贡菊中的黄酮类化合物溶出完全。而较长的酶解时间可能使贡菊中有效成分在受热条件下发生分解。因此，选择酶解时间20 min较为适宜。

2.1.7 复合酶配比对HGTF提取率的影响。由图7可知，随着2种酶配比的改变，HGTF提取率先增大后减小。因为随着纤维素酶在复合酶中所占比重增加，果胶酶所占比重减小，果胶酶对于细胞的分离作用减弱，致使纤维素酶不能充分地将细胞壁降解，细胞内有效成分不能完全溶出。因此，适宜的纖维素酶和果胶酶配比为1∶1。

2.1.8 复合酶质量分数对HGTF提取率的影响。由图8可知，随着复合酶质量分数的提高，HGTF提取率先增加后减小，当复合酶用量达到贡菊重量的0.1%时，HGTF提取率达到最高。因此，适宜的复合酶质量分数为0.1%。

2.2 正交试验

由表2的极差值分析可知，提取条件中超声温度（D）对HGTF提取率的影响最大，其次是超声功率（C），而料液比（A）和超声时间（B）影响较小。再分析各因素不同水平下的综合平均值k，可依次得到A1、B2、C2、D2为最优水平。因此，HGTF提取的最佳条件为A1B2C2D2，即料液比1∶20、超声时间40 min、超声功率280 W、超声温度50 ℃。在此条件下进行工艺验证试验，HGTF得率为2.78%。

2.3 HGTF抗氧化活性研究

2.3.1 对 DPPH·的清除作用。由图9可知，0.05 mg/mL浓度下HGTF溶液和VC溶液对DPPH·的清除率分别为90.47%和95.29%，此后清除率增长缓慢。0.25 mg/mL浓度下HGTF溶液的清除率（95.53%）与同浓度VC溶液的清除率（95.41%）几乎相同，说明HGTF对DPPH·的清除效果较强。

2.3.2 对·OH的清除作用。由图10可知，2种溶液对·OH的清除效果随着浓度增大不断升高。 0.10 mg/mL的HGTF溶液和VC溶液对·OH的清除率分别达73.44%和90.86%，说明HGTF溶液对·OH的清除效果低于VC溶液，但也有较好的清除效果。

2.3.3 对 O2·-的清除作用。由图11可知，HGTF和 VC的浓度与O2·-清除率之间存在量效关系。0.1 mg/mL的HGTF溶液和VC溶液对O2·-的清除率分别为78.73%和95.44%，相同浓度下HGTF溶液对O2·-的清除效果低于VC溶液。

3 结论

复合使用果胶酶与纤维素酶对黄山贡菊粉末进行酶解，果胶酶降解细胞壁中的果胶，降低细胞间的黏结作用，使细胞破碎分离，再利用纤维素酶处理降解细胞壁，2种酶协同作用，增强了对细胞壁的破坏程度，加速细胞内HGTF的溶出。经单因素和正交试验优化，超声波协同酶法提取HGTF得率为2.78%。抗氧化试验结果表明，HGTF溶液对DPPH·有很强的清除能力，与VC溶液无较大差异，同时对·OH和O2·-的清除效果良好。

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