朱思斌，张 雪，江 飞，许易诚，尹宗生

传统上，治疗骨折创伤主要有手术治疗和复位外固定保守治疗，骨组织工程是近期提出和快速发展的新的治疗手段[1]，相比旧的治疗方法，骨组织工程治疗过程中创伤的骨组织可以更快恢复，骨组织修复过程加快，骨折预后功能可以更快接近之前的水平。不同种子细胞的增殖能力和多功能分化潜力各不相同，在不同骨科疾病中的治疗效果差异巨大。现在常用的种子细胞有骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)。ADSCs于2001年第一次被发现，是从脂肪组织中提取的成体干细胞[2]。ADSCs起源于胚胎的中胚层，可以向多种细胞方向分化[3-4]，最终分化成成骨、成脂、成软骨细胞。胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)是一种结构类似于胰岛素的生长因子，在调节细胞生长、促进细胞分化、促进骨与软骨的合成代谢、创伤修复过程中起着重要的作用[5]。研究[6]表明IGF-1可以促进 BMSCs的增殖和成骨分化。目前，ADSCs在体外培养下仍有生长增殖较慢，成骨分化所需时间较长的缺陷，为研究培养方法，该实验通过在培养基中加入不同浓度的IGF-1，探寻IGF-1对体外培养下ADSCs的增殖和成骨分化能力的生物学影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物6月龄SPF级健康新西兰白兔9只，雌雄不限，体质量2.0～3.0 kg，由安徽医科大学实验动物中心提供。饲养环境温度18～29 ℃，相对湿度达40%～70%，新鲜空气换气次数10次/h，气流速度≤0.18 m/s，压差25 Pa，洁净度一万级，氨浓度15 mg/m3，噪音≤60 dB，照度150～300 Lux。

1.2 主要试剂与仪器低糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司；兔脂肪干细胞成骨诱导培养基、兔脂肪干细胞成脂诱导培养基购自美国Cyagen公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；人重组IGF-1粉剂购自美国R&D公司；CCK-8细胞增殖试剂盒为南京诺唯赞生物科技有限公司产品；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶购自美国Sigma公司；CD90单克隆抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性测定试剂盒为南京建成公司产品。CO2细胞恒温培养箱、超速离心机为美国Thermofisher公司产品；倒置荧光显微镜为日本Olympus公司生产；酶标仪为美国BIO-TEK公司产品。

1.3 兔ADSCs的分离与培养取兔1只，戊巴比妥钠麻醉，颈后术区剃毛备皮，俯卧位固定于手术台上，消毒，铺单，在无菌手术间，沿颈后正中切口逐层切开，分离出皮下脂肪，用添加1%含量双抗的PBS冲洗3次，在超净工作台中，仔细剔除组织中的小血管，外包膜和其他组织。使用眼科剪将脂肪剪碎至乳糜状,加入两倍脂肪体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，搅拌均匀，将离心管放置于37 ℃水浴中振荡消化60 min,1 200 r/min 离心 10 min，去除上层油脂、残余脂肪组织。沉淀重悬细胞后，放入200目细胞筛过滤,滤液1 200 r/min离心5 min。使用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞沉淀,接种至细胞瓶，放入恒温细胞箱中培养，首次换液于24 h后,漂洗去除未贴壁细胞，每日镜下观察细胞形态和生长情况，待细胞长满80%左右时，用胰酶在37 ℃恒温细胞培养箱中消化2 min左右，加入血清L-DMEM中和胰酶,设置离心机转速为1 200 r/min，时间5 min,将细胞离心，离心后弃去上清液，将细胞按1 ∶3传代。

1.4 ADSCs表面抗体的检测初代ADSCs传代至P2，细胞在培养皿增殖至80%融合时，用胰酶消化细胞，再用含血清的低糖DMEM终止消化反应，消化后放入离心机1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，用细胞培养基重悬, 调整细胞浓度为3×105/ml，接种于铺好细胞爬片的24孔板上，每孔0.5 ml。待细胞贴壁后，用4%多聚甲醛固定，用PBS浸洗3次，加山羊血清等待30 min。再滴加山羊抗兔CD90一抗,放入湿盒，在4 ℃环境下过夜。第2天用PBST冲洗爬片，重复3次，滴加荧光二抗，湿盒孵育1 h，PBST冲洗爬片3次。滴加DAPI，孵育5 min对ADSCs细胞核染色。染色后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 兔ADSCs向脂肪细胞诱导分化取P2代ADSCs，细胞生长至80%～90%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，调整细胞密度为5×104/ml，以每孔2 ml接种于6孔板中，2 d后，待细胞生长完全融合，依照兔ADSCs成脂诱导培养基说明书，使用兔成脂诱导培养基A液培养3 d，3 d后换为兔成脂诱导培养基B液培养1 d，A液和B液相互交替培养3～5次，每日镜下观察细胞形态，待脂滴足够大，足够圆，用油红O染色，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.6 兔ADSCs向成骨细胞诱导分化取80%融合的P2代ADSCs，加入浓度为0.25%的胰酶消化，调整细胞密度为5×104/ml，以每孔2 ml接种于6孔板中，传代后第2天，待细胞贴壁，换用兔成骨诱导培养基培养4周，镜下观察细胞形态转变后，用茜素红染色，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.7 CCK-8法检测IGF-1对ADSCs增殖活性的影响取P2代ADSCs，以2×104/cm2的密度分别接种于96孔板中培养，每孔加入100 μl培养基。依据说明书，将重组人IGF-1粉剂溶于无菌PBS中，加入成骨诱导培养基，配置成0、5、10、20 ng/ml四种浓度。设置为A组(对照组，0 ng/ml IGF-1)、B组(5 ng/ml IGF-1)、C组(10 ng/ml IGF-1)、D组(20 ng/ml IGF-1)，每组设置3个复孔，培养24 h后加入100 μl含10% CCK-8的低糖培养基，在37 ℃、5% CO2下反应4 h，酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸收值。每日重复CCK-8增殖实验，重复3次，检测7 d。

1.8 茜素红染色检测钙结节及定性分析取P2代ADSCs，以 5×104/cm2的密度分别接种于24孔板中培养，每孔1 ml。细胞贴壁后，换用加入IGF-1的兔成骨诱导培养基，按每培养基IGF-1的浓度将24孔板设置为4组，A组(对照组，0 ng/ml IGF-1)、B组(5 ng/ml IGF-1)、C组(10 ng/ml IGF-1)、D组(20 ng/ml IGF-1)，在培养21 d后，每组对钙结节茜素红染色，定性检测钙结节。

1.9 ALP与钙离子含量的检测及定量分析按上述实验分组在24孔板中培养ADSCs, 在第14天和第24天时，每组取3个孔进行钙离子定量检测，每孔加入1%氯化十六烷基吡啶500 μl，在常温下反应10 min，选择560 nm波长，用酶标仪检测钙离子的含量。每组另外3个孔用胰酶消化后，用含血清的低糖DMEM中和反应，离心去除残余的胰酶，用PBS冲洗细胞两次，加入0.1% Trizon X-100裂解细胞后收集裂解液，在高速离心机中20 000 r/min离心10 min后取上清液，依据ALP检测试剂盒说明书的步骤进行ALP定量检测。

1.10 统计学处理使用SPSS 17.0软件分析数据，组内比较采用独立样本t检验，组间比较使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔ADSCs的形态原代培养后，兔ADSCs于48 h内贴壁，原代细胞呈短梭形或小多角形，72 h后观察，细胞增殖后密度增高时为长梭形成纤维细胞样外观。见图1A。原代培养7 d左右，细胞铺满围绕各中心呈集落样生长。见图1B。

2.2 ADSCs免疫荧光鉴定结果免疫荧光鉴定P2代脂肪干细胞，显示结果为DAPI细胞核染色阳性，见图2A；FITC标记的CD90染色阳性，见图2B。

图1 倒置显微镜下兔脂肪干细胞的形态

A：ADSCs原代培养3 d，呈长梭形成纤维样外观 ×200；B：ADSCs原代培养7 d，细胞铺满围绕各中心呈集落样生长 ×100

图2 ADSCs免疫荧光染色 ×200

A：DAPI细胞核染色阳性；B：FITC标记的CD90染色阳性

2.3 ADSCs成脂诱导分化结果P3代ADSCs成脂诱导后，培养皿中的细胞结构变得不规则，细胞内可见球形透亮脂肪滴，逐渐变大变圆，诱导培养3周后，进行油红 O染色,染色结果为阳性，可见红色球形脂肪滴，见图3A，证明ADSCs成脂分化。

2.4 ADSCs成骨诱导分化结果P3代ADSCs成骨诱导后，细胞形态由细长的梭形结构逐渐变宽大，变成不规则的多角形或多边形。诱导14 d后，可见细胞周围分布小褐色结节。诱导28 d后，形成大量钙结节，茜素红染色后可见钙结节被染成深红色，茜素红染色阳性，见图3B，证明了体外培养的ADSCs有成骨分化的能力。

图3 ADSCs的功能鉴定 ×100

A：ADSCs成脂分化后油红O染色阳性；B：ADSCs成骨分化后茜素红染色阳性

2.5 ADSCs的增殖活性曲线CCK-8法检测结果：随着培养基内IGF-1浓度的增高，ADSCs增殖活性逐渐增强，从第2天开始，5、10、20 ng/ml IGF-1组的增殖活性均高于对照组，其中20 ng/ml IGF-1组高于10 ng/ml IGF-1组和5 ng/ml IGF-1组，10 ng/ml IGF-1组高于5 ng/ml IGF-1组，差异有统计学意义(F=141.675,P<0.05)。见图4。

图4 ADSCs增殖曲线

与A组比较：*P<0.05；与B组比较：#P<0.05；与C组比较：&P<0.05

2.6 钙离子茜素红染色的检测结果成骨诱导分化3周后，ADSCs的茜素红染色结果为阳性，4组细胞镜下均可见红色钙结节。见图5。在镜下观察钙结节密度，密度从大到小排列依次为D组、C组、B组和A组，A组密度最低。证明了IGF-1对ADSCs钙离子的生成的促进作用。

图5 ADSCs钙结节的定型鉴定 ×200

A：A组(0 ng/ml IGF-1)茜素红染色；B：B组(5 ng/ml IGF-1)茜素红染色；C：C组(10 ng/ml IGF-1)茜素红染色；D：D组(20 ng/ml IGF-1)茜素红染色

2.7 ALP和钙离子的定量检测ALP定量检测： ADSCs诱导培养14 d时，D组、C组、B组中ALP活性均高于A组，且D组活性高于C组和B组，C组高于B组,差异有统计学意义(F=60.619,P<0.05)。培养21 d时，D组、C组、B组中ALP活性均高于A组，且D组活性高于C组和B组，C组高于B组,差异有统计学意义(F=162.816,P<0.05)，见图6。钙离子定量检测：诱导培养14 d时，D组、C组、B组的钙离子含量均高于A组，D组高于B组，C组高于B组，差异有统计学意义(F=142.931,P<0.05)，而D组和C组钙离子含量差异无统计学意义，诱导培养21 d时，D组、C组、B组的钙离子含量均高于A组，而且D组高于C组，D组高于B组，C组高于B组，差异有统计学意义(F=71.286,P<0.05)，见图7。

图6 ALP定量检测

与A组比较：*P<0.05；与B组比较：#P<0.05；与C组比较：&P<0.05

图7 钙离子定量检测

与A组比较：*P<0.05；与B组比较：#P<0.05；与C组比较：&P<0.05

3 讨论

骨科临床上，股骨头坏死是最常见的一种疾病，患病年龄多发于35～50岁，发病病因和机制非常复杂，受多种因素影响[7]，在近年的研究中，利用BMSCs等干细胞治疗早期股骨头坏死是热门的研究对象。BMSCs可在体外培养，并向成骨方向和成软骨方向分化，广泛应用于治疗骨坏死等骨科疾病实验研究中[8]。但BMSCs体外培养需要从动物的骨髓腔中取材，其来源少，取材困难，细胞增殖速度较慢。与BMSCs相比，ADSCs来源广泛，取材和培养过程简单，细胞增殖和分化速度快[9]。有研究[10]表明，在体外环境下，ADSCs的增殖能力和向成骨细胞分化潜力强于BMSCs，是骨组织工程中更优秀的种子细胞。

生长因子是一种活性多功能肽物质，由特定细胞分泌，通过与靶细胞结合，可以调节细胞增殖和促进细胞分化。IGF-1是一种生长因子，来源于体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌作用于周围组织，但大部分来自于肝细胞。受垂体分泌的生长激素调控，参与调节绝大部分器官的生长和功能，对细胞的增殖、分化具有非常重要的作用[11-12]。骨质疏松患者中，血清IGF-1水平下降，IGF-1可以促进骨形成、抑制骨破坏、减少骨的吸收，对骨质疏松具有改善作用[13]。IGF-1的结构与胰岛素相似，主要存在血液中，可以降低血糖、促进糖异生、抑制脂肪分解、促进组织利用葡萄糖，对糖尿病继发骨质疏松有着良好的治疗效果。有研究[14]表明，IGF-1会影响骨细胞代谢，是骨形成和骨重建过程中的关键蛋白，又有研究[15]表明，IGF-1可以增强胰岛素生长因子结合蛋白5在成骨细胞中的表达，对成骨细胞的增殖有促进作用。本实验通过在培养基中加入不同浓度的IGF-1，观察其对ADSCs的增殖和成骨分化的影响。本次实验证明，含有5～20 ng/ml IGF-1的成骨培养基，可以增加ADSCs的增殖活性和ALP及钙离子含量，培养基中的IGF-1含量越高，ADSCs的增殖和成骨分化能力越强，具有剂量反应关系，IGF-1对ADSCs的生长增殖和成骨分化具有促进作用。有研究[16]表明，IGF-1通过efn-Eph信号通路和其他多种通路作用于ADSCs，刺激ADSCs的增殖和成骨分化。本实验在成骨培养基中加入的IGF-1最大浓度为20 ng/ml，但增强细胞成骨分化能力的最佳IGF-1浓度仍不能确定，有待进一步实验。