HPLC测定莲不同部位紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量

2019-12-30裴香萍李慧峰杜晨晖刘海霞张淑蓉

中国中医药信息杂志 2019年12期

裴香萍李慧峰杜晨晖刘海霞张淑蓉

摘要：目的建立莲不同部位中紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量的HPLC测定方法。方法采用Diamonsil C₁₈色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.5%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长347 nm，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。结果在上述色谱条件下，紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷与相邻色谱峰的分离度良好。紫云英苷在0.100 5～2.01 μg范圍内有良好的线性关系（r=0.999 6），平均加样回收率为100.96%（RSD=2.68%）;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷在0.026～0.52 μg范围内有良好的线性关系（r=0.999 4），平均加样回收率为98.91%（RSD=2.34%）。结论本研究建立的方法操作简便，结果可靠，可为莲相关药材的质量控制及资源开发提供依据。

关键词：莲;紫云英苷;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷;高效液相色谱法;含量测定

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）12-0075-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.016 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Content Determination of Astragalin and Isorhamnetin-3-O-glucoside in Nelumbo Nucifera Gaertn. by HPLC

PEI Xiangping¹， LI Huifeng¹， DU Chenhui¹， LIU Haixia²， ZHANG Shurong¹

1. Shanxi University of Chinese Medicine， Jinzhong 030600， China; 2. Shanxi Zhendong Ante Biological Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jinzhong 030600， China

Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of astragalin and isorhamnetin-3-O-glucoside in Nelumbo nucifera Gaertn. Methods The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C₁₈ column （200 mm × 4.6 mm， 5 μm）; the column temperature was maintained at 30 ℃; the mobile phase was acetonitrile-0.5% formic acid solution as gradient elution; the flow rate was 0.8 mL/min; the detection wavelength was at 347 nm; the injection volume was 10 μL. Results Under above chromatographic conditions， astragalin and isorhamnetin-3-O-glucoside with adjacent other peaks were among the good separation. Astragalin had a good linear relationship in the range of 0.1005–2.01 μg （r=0.999 6）; the average recovery was 100.96% （RSD=2.68%）. Isorhamnetin-3-O-glucoside had a good linear relationship in the range of 0.026–0.52 μg （r=0.999 3）; the average recovery was 98.57% （RSD=2.34%）. Conclusion The method is convenient and reliable， which can provide evidence for the quality control and resource development of Nelumbo nucifera Gaertn. as a related medicine.

Keywords： Nelumbo nucifera Gaertn.; astragalin; isorhamnetin-3-O-glucoside; HPLC; content determination

莲Nelumbo nucifera Gaertn.为睡莲科多年生宿根草本植物，兼具食用和藥用价值，主要含有生物碱类、黄酮类、花青素、挥发油类、有机酸、甾醇、挥发油及微量元素等^[1]，具有降脂、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗惊厥、保肝等药理作用^[2-4]。我国莲的种植基地主要分布于江西、福建、湖南、湖北、浙江、河北等地，

基金项目：山西省中药材、中药饮片地方标准研究（2011007A）;山西中医药大学科技创新团队（2018TD009）

其中莲子、莲藕以食用为主，荷叶、莲花、莲梗、莲房、莲子心以药用为主。目前莲房、莲须、莲子、莲子心、荷叶收载于2015年版《中华人民共和国药典》（一部）^[5]，对荷叶中荷叶碱、莲子心中的莲心碱成分进行了定量控制，而对莲花、莲梗、莲房的含量测定研究报道相对较少。为控制相关药材质量，本研究对莲不同部位（莲花、莲梗、莲房、荷叶）中的紫云英苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷进行含量测定，为其药食价值利用及资源开发奠定基础。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪，Empower工作站，Waters 2998检测器（美国Waters公司）;ZF-90型暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）;XS205DU电子分析天平（梅特勒?托利多仪器有限公司）。

莲花共13批，7批为开放的花（购于药材市场），6批为花蕾（自采）;荷叶6批，莲房6批，莲梗6批。经山西中医药大学杜晨晖副教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nuciera Gaertn.。样品来源信息见表1。紫云英苷对照品（批号MUST-12092001，纯度>98.0%），成都曼斯特生物有限公司;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷对照品（批号140917，纯度>98.0%），中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C₁₈（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相A为乙腈、B为0.5%甲酸溶液，梯度洗脱（见表2），柱温30℃，流速0.8 mL/min，检测波长347 nm，进样量10 μL。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备

取异鼠李素-3-O-葡萄糖苷2.6 mg，置于5 mL容量瓶中，加乙醇制成每1 mL含0.52 mg的溶液;取紫云英苷对照品适量，加乙醇制成每1 mL含2.01 mg的溶液，备用。

另取异鼠李素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液1 mL、紫云英苷对照品溶液1 mL，稀释至10 mL容量瓶中，得混合对照品溶液（每1 mL含紫云英苷0.201 mg、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.052 mg）。

2.3 供试品溶液制备

取样品，粉碎成粉末（过3号筛），精密称取莲花样品0.5 g，莲房、荷叶样品各3 g，置烧瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再次称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、2.0 mL于2 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积积分值。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。紫云英苷：Y=2 617 223.380 0X+87 318.167 1，r=0.999 6，线性范围为0.100 5～2.01 ?g;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷：Y=3 795 683.72X+47 996.58，r=0.999 4，线性范围为0.026～0.52 ?g。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液（紫云英苷0.080 4 mg/mL、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.020 8 mg/mL）10 ?L，连续进样6次，测定峰面积积分值，计算得RSD分别为1.13%、0.97%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液10 ?L，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、8、10、12 h进样，记录色谱峰峰面积积分值，计算得紫云英苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷峰面积RSD分别为1.24%、1.73%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批莲花样品（批号160816），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，精密吸取10 ?L，分别测定峰面积积分值，并计算含量。结果样品中紫云英苷元平均含量为0.349%，RSD=2.52%;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷平均含量为0.064%，RSD=2.34%。表明本法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的莲花供试品（批号160816）0.25 g，研细，精密称取6份，分别精密加入1 mL混合对照品溶液（紫云英苷0.87 mg/mL，含异鼠李素-3-O-葡萄糖苷0.16 mg/mL），按“2.3”项下方法制备，进样10 μL测定，计算回收率。结果紫云英苷平均回收率为100.96%，RSD=2.68%;异鼠李素-3-O-葡萄糖苷平均回收率为98.91%，RSD=2.34%。见表3、表4。

2.9 样品含量测定

取样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样测定，以外标法计算含量，结果见表5。

3 讨论

本试验莲花样品同时收集了花蕾和开放的花。测定结果表明，于药材市场购买的莲花中紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量较高，其多为已开放的花，主要为花瓣;而自采样品均为未开放的花蕾，其紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量相对较低，可能由于花蕾中莲房、雄蕊、雌蕊占有一定比例。测定结果也表明，莲房、莲梗样品中2种成分含量最低。可见，紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷等黄酮类成分主要集中于莲花的花瓣中。这与文献报道黄酮类化合物主要存在于荷叶及莲花中^[6-7]一致。因此，临床用药及资源开发中应注意对莲的不同部位区别应用。

莲花在文献记载中多以花蕾入药，《山西省中药材标准（一九八七年版）》^[8]、《湖南省中药材标准（2009年版）》^[9]、《山东省中药材标准（2002年版）》^[10]均以花蕾入药，《北京市中药饮片标准（二OO年版）》^[11]以花蕾或将开放的花入药，《福建省中药材标准（2006年版）》^[12]以花蕾或花入药。但安徽亳州药材市场、河北安国药材市场调研及所购买的莲花主要为花瓣，几乎不含有莲房部位;样品采集过程中，种植户反映夏季采集未开放的花蕾会影响秋冬季节莲藕的产量。因此，对于药食两用植物莲的开发应全方位综合考虑，既要关注某些部位的药用价值，也应注重更广泛的食用价值。另外，对于莲的不同部位，适宜的采收时间是保证其质量的主要因素，在相关标准中应予以明确规定。

本试验考察了不同的提取溶剂，分别以甲醇、无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇作为提取溶剂，结果表明，用70%乙醇提取后，紫云英苷及异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量较高，故以70%乙醇作为提取溶剂。试验还考察了室温冷浸24 h、超声提取30 min、超声提取60 min、回流提取1 h等不同提取方法，结果表明，回流提取1 h的样品中紫云英苷含量较高，故提取方法选择回流提取1 h。

本试验参考相关文献报道^[13]，比较了乙腈-0.2%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液的不同比例作为流动相，后经多次试验摸索，确定了乙腈-0.5%甲酸水溶液的梯度分离条件，使各色谱峰达到基线分离，与相邻色谱峰分离度均大于1.5，紫云英苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷理论塔板数均大于3000，对称因子均在0.95～1.05之间。

参考文献：

[1] 赵小亮，章军，马小军，等.莲不同药用部位化学成分研究综述[J].中国中医药信息杂志，2012，19（1）：106-109.

[2] 唐裕芳，张妙玲，刘忠义，等.荷叶生物碱的提取及其抑菌活性研究[J].广州食品工业科技，2004，20（2）：51-52，39.

[3] 涂长春，李晓宇，杨军平，等.荷叶生物总碱对肥胖高脂血症大鼠减肥作用的实验研究[J].江西中医学院学报，2001，13（3）：120-121.

[4] 郭兴峰，傅茂润，杜金华，等.不同干燥方法对荷花花瓣抗氧化活性和化学成分的影响[J].食品与发酵工业，2010，36（2）：145-149.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：273-275.

[6] 趙小亮，王智民，马小军，等.荷叶化学成分研究[J].中国中药杂志， 2013，38（5）：703-708.

[7] 王玲玲，刘斌，石任兵，等.荷叶黄酮类化学成分研究[J].北京中医药大学学报，2008，31（2）：116-118.

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[9] 湖南省食品药品监督管理局.湖南省中药材标准[M].长沙：湖南科学技术出版社，2009：167.

[10] 山东省药品监督管理局.山东省中药材标准[M].济南：山东友谊出版社，2002：52.

[11] 北京市药品监督管理局.北京市中药饮片标准[M].2000：269.