李玉霞 史正刚 祁辉

摘要：目的  观察小儿开胃增食合剂对厌食症幼龄大鼠胃窦组织生长素（Ghrelin）、血管活性肠肽（VIP）及其受体表达的影响，探讨其治疗小儿厌食症的相关机制。方法  将60只幼龄SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组和小儿开胃增食合剂低、高劑量组，每组12只，采用病因模拟法建立厌食大鼠模型。各给药组给予相应药物干预，6周后采用荧光定量PCR及Western blot分别检测大鼠胃窦组织Ghrelin、VIP及其受体mRNA和蛋白表达。结果  与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2 mRNA和蛋白表达均显著下调（P<0.05）;与模型组比较，阳性对照组、小儿开胃增食合剂高剂量组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2的mRNA和蛋白表达均显著上调（P<0.05）。结论  小儿开胃增食合剂通过影响模型大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2表达，进而改善胃的容受性舒张和紧张性收缩，调整胃的机械运动功能，发挥治疗小儿厌食症的作用。

关键词：小儿开胃增食合剂;厌食症;生长素;血管活性肠肽;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）12-0050-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.012  开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture on Expressions of Ghrelin， VIP and Its Receptors in Gastric Antrum Tissues of Juvenile Rats with Anorexia

LI Yuxia^1，2， SHI Zhenggang¹， QI Hui¹

1. TCM Clinical College in Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China;2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China

Abstract： Objective To observe the effects of Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture on the expressions of Ghrelin， VIP and its receptors in gastric antrum tissues of juvenile rats with anorexia; To explore the relevant mechanism for treating anorexia in children. Methods Totally sixty juvenile SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive control group， Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture low-， and high-dosage groups， with 12 rats in each group. Juvenile rat model with anorexia was established by imitating the major cause of infantile anorexia. Each administration group was given relevant medicine for intervention. After 6 weeks， the mRNA and protein expressions of Ghrelin， VIP and its receptors in rat gastric antrum tissue were detected by fluorescence quantitative PCR and Western blot. Results Compared with the blank group， the mRNA and protein expressions of Ghrelin and its receptors GHSR， VIP and VPAC2 in the model group were significantly down-regulated （P<0.05）; Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of Ghrelin and GHSR， VIP and VPAC2 in the positive control group and Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture high-dosage groups were significantly up-regulated （P<0.05）. Conclusion Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture can improve the gastric receptive relaxation and tension contraction， regulate the gastric mechanical function by affecting the expressions of Ghrelin and its receptors GHSR， VIP and VPAC2 in gastric antrum tissues， so as to play a role in the treatment of anorexia in children.

Keywords： Xiaoer Kaiwei Zengshi Mixture; anorexia; Ghrelin; VIP; rats

小儿厌食症是指小儿长期见食不贪、食欲不振、甚至拒食的一种慢性食欲障碍性疾病。流行病学调查结果显示，婴儿和学龄前儿童厌恶进食发生率为12%～34% ^[1]。近年来，随着物质生活水平的提高及饮食结构的改变，其发病率呈上升趋势，长期厌食可导致营养不良、免疫力下降、反复呼吸道感染，严重影响小儿生长发育、智力及身心健康。厌食症的发病机制复杂，其中胃肠运动功能障碍和胃肠肽分泌异常是最为重要的影响因素。在众多胃肠肽中，双重分布于脑组织和胃肠道的生长素（Ghrelin）和血管活性肠肽（VIP）与胃的容受性舒张与紧张性收缩直接相关，在调节胃肠运动功能方面发挥着非常重要的作用。目前，现代医学多采用心理治疗、补锌和促进胃肠动力药等对症治疗，但促进胃肠动力药明显的不良反应及疗效不确定性限制了其临床应用，而中医药治疗本病方法众多，具有明显优勢。小儿开胃增食合剂是全国名中医张士卿教授通过多年临床经验总结，将厌食症根本病机——“脾运失健、胃纳失常”与“脾健不在补贵在运”的指导思想相结合，融合现代制剂工艺研制而成。课题组前期研究表明，小儿开胃增食合剂在改善胃肠运动、促进消化酶分泌、调整胃肠激素分泌、影响食欲调节因子等方面均有显著的效应^[2-6]。本研究观察小儿开胃增食合剂对厌食症幼龄大鼠胃窦组织Ghrelin、VIP及其受体表达的影响，探讨其治疗小儿厌食症的相关机制。

1  材料与方法

1.1  动物

1周龄健康SD大鼠60只，SPF级，雌雄各半，体质量（80±10）g，甘肃中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号SYXK（甘）2015-0005。饲养于甘肃中医药大学实验动物中心，温度20～26 ℃、日温差≤4 ℃、相对湿度40%～70%，最小换气量15～20次/h，日光灯采光，12 h/12 h明暗交替。普通饲料（北京科奥协力饲料有限公司）经高温高压灭菌，自由摄食饮水。

1.2  药物

小儿开胃增食合剂（苍术、茯苓、槟榔、鸡内金、乌梅、胡黄连、炙甘草），甘肃中医药大学附属医院制剂室提供，240 mL/瓶，批号170210;江中健胃消食片，江中药业股份有限公司，批号17031001。

1.3  主要试剂与仪器

目标引物（Takara合成，LZD18070），Trizol（Invitrogen公司15596-018），反转录试剂盒（Takara RR037A），扩增试剂盒（Takara Code No.D310），组织裂解液（RIPA，索莱宝科技公司，20180419），PMSF（索莱宝科技公司，P0100），BCA蛋白定量试剂盒（索莱宝科技公司，PC0020），SDS-Page凝胶试剂盒（索莱宝科技公司，20180223），GAPDH（YM3445）、Ghrelin（ab57222）、生长激素释放激素受体（GHSR，ab95250）、VIP（ab8556）、VPAC2（ab28624）和辣根过氧化酶兔二抗（北京中杉金桥生物技术公司，133599），ECL发光液（索莱宝科技公司，PE0020）。倒置显微镜（CKX41，日本Olympus），电泳仪（北京六一仪器厂，DYCZ-40D），蛋白转印系统（北京六一仪器厂，DYCZ-40D），化学发光成像系统（BioSpectrum510，美国UVP），CFX real-time PCR system（Bio-Rad，CA 1854095）。

1.4  造模、分组和给药

将60只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为空白组12只、造模组48只。空白组给予普通饲料喂养，造模组采用病因模拟法制备厌食大鼠模型^[7]，即用特制饲料（鱼松、奶粉、玉米粉、黄豆粉、白糖、鲜鸡蛋、鲜肥肉按1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2比例混匀，捏成饼状，晾干，4 ℃冷藏备用）喂养，共饲养28 d，每日记录大鼠摄食量及体质量。以造模组大鼠摄食量较空白组平均降低30%～60%，或体质量低于空白组10%～15%，为模型成功评定标准^[7]。待造模成功后，再随机将造模组分为模型组、阳性对照组、小儿开胃增食合剂低剂量组（中药低剂量组）、小儿开胃增食合剂高剂量组（中药高剂量组），每组12只。同时开始灌胃给药，灌胃剂量按人与大鼠换算系数^[8]折算成大鼠等效剂量。中药高、低剂量组分别给予小儿开胃增食合剂（0.3 g原药材/mL）1.4、5.7g/（kg·d）灌胃，阳性对照组给予健胃消食片水溶液0.45 g/（kg·d）灌胃，空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。给药体积均为1 mL/100 g，每日1次，连续42 d。

1.5  标本采集

于末次给药后禁食不禁水，次日采集标本，大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，脱臼处死，取胃窦部组织置于液氮中，-80 ℃冰箱保存，分别留待荧光定量PCR和Western blot检测。

1.6  荧光定量PCR检测大鼠胃窦组织生长素、血管活性肠肽及其受体mRNA表达

取大鼠胃窦组织0.1 g，采用Trizol法提取总RNA，每份样品取2 ?L，反转录得到相应cDNA，分别加入Ghrelin、GHSR、VIP，VAPC2和GAPDH的引物进行RT-PCR扩增，用荧光定量PCR仪进行基因表达量的检测，扩增反应体系为20 ?L。扩增条件：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s和60 ℃变性30 s，40个循环。引物设计见表1。

1.7  Western blot检测大鼠胃窦组织生长素、血管活性肠肽及其受体蛋白表达

取大鼠胃窦组织，加1 mL蛋白裂解液RIPA，提取总蛋白。收集含有裂解液细胞，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果，每孔加40 ?g目的蛋白;加入电泳液，并进行组织蛋白电泳，转PVDF膜，根据目的蛋白选择相应的条带，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，洗膜后，加入稀释后的一抗4 ℃孵育，过夜;再加二抗室温孵育2 h，曝光，所得图片采用ImagePro Plus 6.0软件进行扫描，利用GAPDH校准后计算其灰度值。

1.8  统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，方差齐采用LSD检验法，方差不齐用Games-Howell检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  模型评定标准

2.1.1  大鼠摄食量变化

造模第1日，与空白组比较，造模组大鼠摄食量无明显差异（P>0.05）;第7日，造模組较空白组摄食量平均降低37.5%，差异有统计学意义（P<0.05）;至第28日，造模组大鼠较空白组摄食量平均降低40.6%，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。符合厌食症模型摄食量评定标准^[7]，提示模型制作成功。

2.1.2  大鼠体质量变化

造模第1日，与空白组比较，造模组大鼠体质量无明显差异（P>0.05）;第7日，造模组大鼠较空白组体质量平均降低19.0%，差异有统计学意义（P<0.05）;至第28日，造模组大鼠较空白组体质量平均降低30.0%，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。符合厌食症模型体质量评定标准^[7]，提示模型制作成功。

2.2  小儿开胃增食合剂对模型大鼠摄食量及体质量的影响

干预第7～42日，与空白组比较，模型组大鼠摄食量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，中药低剂量组摄食量变化趋势与其相同，差异无统计学意义（P>0.05）;第21日，与模型组比较，阳性对照组和中药高剂量组大鼠摄食量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。干预第7～42日，与空白组比较，模型组大鼠体质量明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，中药低剂量组大鼠体质量变化趋势始终未见明显改变，差异无统计学意义（P>0.05），而阳性对照组和中药高剂量组大鼠体质量则表现出逐渐增加趋势，且从第28日起，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。

2.3  小儿开胃增食合剂对模型大鼠胃窦组织生长素、血管活性肠肽及其受体mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2 mRNA表达均显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组和中药高剂量组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2 mRNA表达均显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）;与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR mRNA表达差异均无统计学意义（P>0.05），VIP及其受体VPAC2 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05）。见表6。

2.4  小儿开胃增食合剂对模型大鼠胃窦组织生长素、血管活性肠肽及其受体蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，阳性对照组、中药高剂量组大鼠胃窦组织Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2蛋白表达均显著升高（P<0.05），中药低剂量组大鼠胃窦组织Ghrelin受体GHSR蛋白表达显著升高（P<0.05）;与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠胃窦组织GHSR、VIP及其受体VPAC2蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表7、图1。

3  讨论

中医学认为，小儿厌食症病因多与先天不足、喂养不当、久病等因素有关^[9]。但无论何种因素所致，其根本病机为脾运失健、胃纳失常。张士卿教授认为，本病病位在中焦，不仅责之脾胃虚弱，脾运失健，同时还存在胃有食积，中焦气滞，湿困热郁，兼或虫证内扰等，以致胃失和降的病理变化。治当以调理脾胃，启复转运之机为基本原则，脾以运为健，胃以和为贵，调理脾胃应遵《幼科发挥》“重在助运，贵在中和”之旨，予以运脾开胃，消食化积之法。小儿开胃增食合剂方中苍术味微苦，芳香悦胃，功能醒脾助运，开郁宽中，疏化水湿，通阳泄浊，与脾喜燥恶湿、得阳则运的习性相符，可疏脾湿之蕴，散脾经之寒，舒脾经之滞，能就脾之所喜而去脾之所恶，使脾气舒展，运化之机恢复而达健旺;茯苓性平，作用和缓，可健脾补中，与苍术相配燥湿而不伤脾，补脾而不敛湿，又补中有运，补运结合，共为君药。槟榔味辛，入胃肠，功擅行胃肠之气，消积导滞;鸡内金性平，有较强消食化积作用，并能健运脾胃。两药合用可行气和胃，运脾化积，是谓臣药。脾虚致水湿内生，加之小儿体禀“纯阳”，且饮食停积胃肠而化热，因此湿热内生，阻于胃肠，鉴于此，故选用胡黄连。胡黄连味苦寒，入胃肠，善清胃肠湿热;乌梅酸收，可益气开胃，与胡黄连配伍可助其除疳清热之功，与槟榔相合可助其安蛔，合甘草又可化阴，故能生津而护胃;炙甘草益气补中，调和诸药，三药共为佐使。诸药合用，可谓消补并举，动静相和，标本同治，补而不滞，消导而不伤正，共奏运脾开胃、消食化积、行气补中之功，正合小儿厌食症之病机。

現代医学认为，小儿厌食症以胃进食功能失常最为关键，主要表现为胃的机械运动失常。这与中医学所认识的“胃纳失常”病机相一致。胃的3种运动形式（容受性舒张、紧张性收缩及蠕动）共同参与完成胃容纳食物、混合食糜以及胃排空功能，从而保证正常的进食与消化^[10]。而调控和维持胃肠道正常运动兴奋和抑制的平衡，主要由中枢和胃肠神经系统释放的神经递质，作用于相应的受体所完成，因而其对胃肠运动的调节极为关键^[11-13]。而胃肠运动功能的异常又会反馈性对大脑中枢神经的调节产生影响，从而调控相关胃肠肽的表达，因此，胃动力改变后，胃排空时间与胃肠肽激素水平异常存在因果关系^[14]。

Ghrelin是由胃窦泌酸细胞分泌的内源性胃肠肽， GHSR mRNA在全消化道平滑肌和下丘脑中均有表达^[15]。研究发现，Ghrelin与GHSR结合后，可调节胃肠运动和能量代谢平衡^[16]。对胃的机械运动，大鼠体内Ghrelin水平与胃窦部Ⅲ相收缩运动存在高度一致性^[17-18]，并可显著加快大鼠胃排空，减少胃内食物残留量。当体内碳水化合物含量过高时，会导致Ghrelin的mRNA表达下调^[19]，引起胃肠运动障碍。

VIP是一种能显著且持续松弛胃肠道平滑肌的多肽类激素。VIP在胃肠道的分布最为广泛，通过与其受体结合而发挥生理功能。在胃肠道平滑肌中，VIP与其受体VPAC2相互作用，刺激cAMP浓度增加以松弛平滑肌，这一作用通过迷走-迷走反射而引起胃的容受性舒张^[8]。研究发现，饮食积滞因素能通过影响VIP表达进而造成胃肠道生理功能紊乱，且通过调节体内VIP水平可改善胃肠道蠕动^[20]。

本实验结果显示，模型组大鼠出现摄食量下降，体质量不增等厌食症状的同时，胃窦组织中胃肠肽Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2既表现出基因表达显著下调，也出现蛋白表达显著下调。经药物干预后，阳性对照组和中药高剂量组摄食量表现出逐渐增加趋势，并在给药第21日，与模型组比较有显著差异;给药第28日，与模型组比较，在体质量方面，阳性对照组和中药高剂量组表现出显著差异，与胃窦组织Ghrelin、VIP水平及GHSR、VPAC2 mRNA表达均显著上调的变化趋势相一致，表明小儿厌食症的发生与Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2表达变化密切相关，而小儿开胃增食合剂可通过上调其基因和蛋白表达水平，起到增加摄食量、促进胃排空而治疗小儿厌食症。因此，小儿开胃增食合剂可通过影响胃肠肽Ghrelin及其受体GHSR、VIP及其受体VPAC2表达，进而改善胃的容受性舒张和紧张性收缩，调整胃的机械运动功能，使其恢复平衡状态，起到治疗小儿厌食症的作用。

参考文献：

[1] 马融，胡思源，王俊宏，等.小儿厌食中药新药临床试验设计与评价技术指南[J].药物评价研究，2015，38（3）：244-250.

[2] 史正刚，李玉霞，刘婷.增食灵颗粒对小儿厌食症动物模型瘦素的影响[J].中医儿科杂志，2009，5（2）：10-11.

[3] 吴丽萍，王艳丽.小儿增食灵合剂对小儿厌食症动物模型胃蛋白酶活性和胃酸分泌量的影响[J].中医儿科杂志，2007，3（3）：26-28.

[4] 吴丽萍，任耀全，王艳丽.小儿增食灵合剂对小儿厌食症大鼠促胃液素水平的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2010，18（5）：297-299.

[5] 吕晓武，史正刚.增食灵口服液对幼龄鼠胃肠运动功能的影响[J].中国中医药信息杂志，2009，16（1）：42-43.

[6] 王继芳，吴丽萍，史正刚，等.小儿开胃增食合剂对小儿厌食症大鼠神经肽Y的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2016，24（2）：92-94.

[7] 汪受传，张月萍，陶勇，等.特制饲料喂养幼龄大鼠建立小儿厌食症模型[J].南京中医药大学学报，1999，15（3）：148-151.

[8] 王春田.医学实验动物操作基本技术[M].北京：科学出版社，2018：70.

[9] 马融.中医儿科学[M].北京：中国中医药出版社，2018：114.

[10] 王庭槐.生理学[M].北京：人民卫生出版社，2018：190-191.

[11] THOMAS R P， HELLMICH M R， TOWNSEND C M， et al. Role of gastrointestinal hormones in the proliferation of normal and neoplastic tissues[J]. Endocrine Reviews，2003，24（5）：571-599.

[12] REHFELD J F. The new biology of gastrointestinal hormones[J]. Physiological Reviews，1998，78（4）：1087-1108.

[13] 郭椿，贺平.脑肠轴及其研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2017， 17（95）：89-91.

[14] 黄凯裕，梁爽，傅淑平，等.基于脑肠轴理论探讨胃肠调理在针灸治疗脑病中的应用[J].中医杂志，2016，57（13）：1099-1104.

[15] ZHENG J， ARIGA H， TANIGUCHI H， et al. Ghrelin regulates gastric phase Ⅲ-like contractions in free lymoving consciousmice[J]. Neurogastroenterol Moti1，2009，21（1）：78-84.

[16] 徐珞，孙向荣，韩晓华，等.Ghrelin在大鼠神经系统中的表达对胃黏膜的保护作用[J].世界华人消化杂志，2006，14（8）：752-757.

[17] ARIGA H， TSUKAMOTO K， CHEN C， et al. Endogenous acyl ghrelin is involved in mediat-ing spontaneous phase Ⅲ-like contractions of the rat stomach[J]. Neurogastroenterol Moti1，2007，19（8）：675- 680.

[18] FUJITSUKA N， ASALCAWA A， HAYASHI M， et al. Selective serotonin reuptake inhibitors modify physiological gastrointestinal motor activities via 5-HT2c receptor and acyl ghrelin[J]. Biol Psychiatry，2009，65（9）：748-759.

[19] CHOWDHURY E A， RICHARDSON J D， KOSTAS T， et al. Carbohydrate-rich breakfast attenuates glycaemic， insulinaemic and ghrelin response to ad libitum lunch relative to morning fasting in lean adults[J]. British Journal of Nutrition，2015， 114（1）：98-107.

[20] TIAN J， LI M， ZHAO J， et al. Research on the traditional Chinese medicine treating gastrointestinal motility in diabetic rats by improving biomechanical remodeling and neuroendocrine regulation[J]. American Journal of Translational Research，2017， 9（5）：2219.

（收稿日期：2019-04-01）

（修回日期：2019-05-21;編辑：华强）