范书华，董清山*，赵团结，解国庆，王 艳，赵云彤，时新瑞

（1.黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157000；2.南京农业大学，江苏 南京 210095）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）淀粉包含支链淀粉和直链淀粉，马铃薯支链淀粉具有抗老化性、改善冻融平衡、高膨胀性、高吸水性及增稠作用等功能，被广泛应用于食品、包装材料的制作、医药和建筑工业等领域[1]。工业生产上分离直链淀粉和支链淀粉工艺复杂、费时、费力[2]，因此，培育出支链淀粉含量更高的马铃薯品种具有重要的经济和社会意义[3]。

通过对豌豆突变体[4]、马铃薯[5]及禾谷类突变体[6]的研究表明，植物体内如果缺少GBSS 蛋白，直链淀粉就不能合成。刘玉汇等[7]利用RNAi 技术降低GBSS 基因转录水平获得了支链淀粉含量比对照高10.31%～20.92%的马铃薯，并发现支链淀粉含量与基因沉默效率呈极显著正相关关系。刘永强[8]通过转基因的方法干扰GBSS 基因表达从而获得了支链淀粉比例高达99.2%的马铃薯材料。Andersson等[9]通过基因编辑的方法获得了马铃薯GBSS突变体材料‘P24023’，GBSS基因功能丧失后，马铃薯支链淀粉含量明显升高。马铃薯栽培品种‘克新12号’是黑龙江省农业科学院马铃薯研究所利用自交种子选育而成的高淀粉品种[10]，具有高产、抗病、淀粉含量高的优点，已经在全国多地推广[11]。‘克新12号’属加工型品种，总淀粉含量为16.5%，直链淀粉占24.7%，支链淀粉占总淀粉比例为75.3%左右[12]。为了培育更适合加工生产支链淀粉的马铃薯种质，本课题组通过有性杂交的方法把高支链淀粉基因gbss由‘P24023’导入到‘克新12号’。

高分辨率熔解曲线（High resolution melting，HRM）是近些年发展起来的新技术，该技术可以分辨单个碱基的基因突变，具有灵敏度高，成本低，操作简便的特点，已在水稻、玉米等作物上广泛应用[13]。本研究针对gbss 基因的功能性变异位点，将其开发为HRM分子标记，为进一步将gbss基因导入到更多的适合本地栽培的马铃薯品种中，创制更多高支链淀粉马铃薯品种提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中所用马铃薯突变体材料‘P24023’由瑞士农业科学大学Hofvander教授馈赠，支链淀粉含量占总淀粉含量比例为99.5%；其余11份马铃薯材料由黑龙江省农业科学院牡丹江分院收集保存（表1）。这12份马铃薯材料用于GBSS基因突变位点多态性检测。

为了培育适合本地种植的高支链淀粉马铃薯品种，以‘P24023’突变体为供体，利用gbss 基因改良‘克新12号’。以‘克新12号’为母本和‘P24023’为父本，通过去雄杂交，得到杂交F1代实生种子，F1代自交结实得到F2代实生种子。由于12份马铃薯材料中有11份材料GBSS基因的突变区域没有多态性，为控制试验规模，挑选6个当地农业生产中的主栽品种，‘克新12号’、‘尤金’、‘早大白’、‘东农303’、‘大西洋’、‘夏波蒂’和高支链淀粉突变体材料‘P24023’以及‘克新12号’和‘P24023’的F2代群体用于分子标记功能分析。每个单株取健康叶片用于提取基因组DNA。

常规分子生物学试剂购自上海生物工程有限公司。

1.2 引物设计及信息

根据‘P24023’突变体中的GBSS 基因序列设计HRM引物gbss-F/gbss-R（gbss-F：5'-tctctataca ggtcatggacgc-3'，gbss-R：5'-cctcaagtctgccgatgaa gcc-3'），引物由深圳华大基因公司合成。

1.3 PCR扩增以及HRM检测

依据刘玉汇等[7]的方法提取马铃薯叶片基因组DNA。PCR 反应体系如下：10 ng 基因组DNA，Buffer（Mg2+plus），250 μmol/L dNTPs，0.1 μmol/L gbss-F/gbss-R 引 物， 0.5 U rTaq DNA 聚 合 酶（TaKaRa，Japan）和0.1 μL 20×EvaGreen 荧光染料（Biotium USA），加ddH2O 补足至10 μL。PCR 扩增程序如下：94 ℃4 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃10 s，39 个循环；72 ℃1 min；95 ℃1 min；25 ℃1 min。PCR结束后，每个反应体系中加入1 μL温度内参，2 500 r/min 离心1 min 后即可进行高分辨率熔解曲线采集及分型，后续具体操作参考金名捺等[13]的方法。

表1 12份用于GBSS多态性分析的马铃薯品种Table 1 Twelve potato varieties used for polymorphism analysis of GBSS

PCR产物同时送到华大基因进行DNA测序，确定不同马铃薯材料的基因类型；序列比对使用Lasergene软件。

1.4 淀粉含量测定

采用水沉淀法[14]制备马铃薯块茎淀粉，采用双波长法分别测定支链淀粉和直链淀粉含量，两者和为总淀粉含量，计算支链淀粉占淀粉的百分率。测定直链淀粉含量采用的波长分别为λ1=500 nm，λ2= 600 nm；测定支链淀粉采用的波长分别为λ3=700 nm，λ4=590 nm。

2 结果与分析

2.1 GBSS功能基因特异性分子标记开发

为了给高支链淀粉马铃薯育种提供快速检测的分子标记，本研究在‘P24023’突变体的GBSS基因突变位点两侧设计了gbss-F/gbss-R 引物，分别以12份马铃薯叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增。结果显示PCR扩增特异性好，片段大小也与预测的一致（图1）。

通过对12份马铃薯材料（表1）的基因组进行扩增、测序，对测序结果进行比对分析发现，除‘P24023’外，其他11份材料在GBSS基因突变区域均没有多态性（图2）。

2.2 gbss基因功能分子标记的验证

由于12份马铃薯材料中有11份材料GBSS基因的突变区域没有多态性，选择了6份栽培品种‘克新12号’、‘尤金’、‘早大白’、‘东农303’、‘大西洋’、‘夏波蒂’和带有gbss 突变的‘P24023’以及‘P24023’ב克新12号’的杂交F2代群体用于标记的功能验证。种植F2代实生种子共得到单株208 株，利用gbss-F/gbss-R引物对上述马铃薯育种材料进行HRM 分型检测，结果被检测群体被分为3 种类型（图3）。一种是与‘P24023’分为一类的峰图（长实线）共6 株，除‘P24023’外，有5 株F2代单株，简称‘P群’；一种是与普通栽培品种分为的峰图（空心曲线）共10株，除6个栽培品种外，有4株F2代单株，简称‘K群’；而F2代群体中绝大多数被分为第三类（实心连续曲线），共199株，简称‘F2杂群’。每份材料做3次重复，每次结果都一致，证明该标记具有很好的稳定性。

图1 引物gbss-F和gbss-R对马铃薯基因组DNA的扩增效果检测Figure 1 Detection of amplification effects of primers gbss-F and gbss-R for potato genomic DNA

2.3 淀粉含量测定

根据HRM 分型结果，每种群体（P 群、F2杂群和K群）植株分别挑选4个单株，对应植株所结块茎用于淀粉含量测定。结果显示P群植株块茎支链淀粉占总淀粉比例为99.1%，与‘P24023’相当；K群植株的块茎支链淀粉占总淀粉比例为75.5%，与‘克新12号’支链淀粉比例相同；而F2杂群植株的块茎支链淀粉占总淀粉比例为80.5%（图4）。说明通过杂交转育gbss基因可以使块茎中的支链淀粉含量占总淀粉的比例显著上升。

以上结果表明，HRM能够对马铃薯支链淀粉基因的改良过程进行很好的跟踪。因此，gbss-F/gbss-R可以作为鉴定和检测高支链淀粉基因gbss的特异性功能分子标记，为马铃薯种质资源的创制和分子标记辅助改良提供技术支持。

图2 12份马铃薯材料GBSS基因位点扩增产物的测序结果比对分析Figure 2 Sequence analysis of amplified products of GBSS locus from 12 potato materials

图3 引物gbss-F和gbss-R对马铃薯群体的HRM分型效果Figure 3 HRM genotyping results of potato populations by gbss-F/gbss-R primer sets

图4 马铃薯支链淀粉含量测定Figure 4 Amylopectin content of different potato tubers

3 讨 论

马铃薯是黑龙江省重要作物[15]，除作为食物外，大部分用于工业生产淀粉原料使用。马铃薯淀粉包括直链淀粉和支链淀粉，由于性质不同，工业上需要把两种淀粉分别纯化。如果农业生产出的马铃薯只含有一种淀粉，就省去淀粉分离成本。关于直链淀粉的合成关键基因已有深入的研究，通过反义或干涉表达GBSS基因可以得到高支链淀粉含量马铃薯[4-6]。

随着分子生物学的发展，分子辅助育种得到越来越多的应用，分子标记可以准确跟踪一些重要的作物性状，而不受环境影响。目前马铃薯的分子标记主要是采用DNA电泳的方法进行[16]，该方法存在费时、费力、高成本、低效率等缺陷；改进后的小片段HRM方法是一种准确、高效、低成本的突变位点检测方法，高度灵敏性以及优良的准确性使得HRM方法在作物分子标记育种上具有巨大的应用潜力。栽培马铃薯是四倍体作物，四倍体基因组杂合度较高，其基因型研究相对二倍体复杂，其F2代分离单株应该有多种基因型。本研究所开发的标记将杂交群体后代分为3种类型（图3），是因为‘F2杂类’的199 株单株应该包括了除亲本类型的多种基因型，所以单株间高分辨率熔解曲线有些差别（图3），具体有哪些基因型还需进一步实验验证。

本研究基于GBSS基因突变位点设计的HRM标记分型检测方法能够高效、准确地进行高支链淀粉马铃薯资源的鉴定及改良后代群体的高通量筛选检测。本研究创制的高支链淀粉马铃薯新种质，总淀粉含量跟‘克新12号’相当，但支链淀粉含量大幅度升高，为将来生产上提供更适合加工的马铃薯品种提供了优质资源。