郗艳丽，周旋，霍明洋，翟晓瑞，马鹏，马一芯，张栩铭，徐斌

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

香水柠檬[Citrus Limon（L.Burm.F.）]为台湾培育品种，属于须根系植物，性喜温暖、耐阴、耐寒、不怕热，其果型修长，果大色美，长圆型，该果香气浓郁且维持较持久，完全没有其他柠檬的酸涩味道，因其汁水香气浓郁，故有“香水柠檬”之称，因其无籽也叫“无籽柠檬”。香水柠檬一年四季花果同期，所以也称“台湾四季香水柠檬”。其最大特点是高产早产、果形美观、汁多味香。成熟时果皮黄绿至淡黄色，形状美观，果皮光滑，味道清甜，肉嫩汁多，气味香郁，无苦涩味，可以直接榨成果汁。香水柠檬能生津止渴，清热解暑，行气消食，化痰止咳，具有美容护肤、调味、补充铁钙、杀菌等功效，更是养颜美容、瘦身之佳品[1]。香水柠檬是世界上最有药用价值的水果之一，它富含维生素B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素 C、P、柠檬酸、烟酸、苹果酸、高量钾元素和低量钠元素等，具有防止肾结石形成、防治心血管疾病、防治动脉血管硬化和血栓的形成、止血、抗癌、治疗腹泻、预防流感等作用[2-3]。香水柠檬果汁具有较好的抗氧化作用[4]，其对预防老年性疾病有较好的作用。香水柠檬果皮富含色素、果胶和柠檬精油等成分，与柠檬果皮一样，可成为生产香精香料及食品工业、轻纺工业、医药业的重要原材料[5-10]。为有效利用资源，变废为宝，本研究拟采用响应曲面法优化香水柠檬果皮绿色素的提取工艺，为香水柠檬的开发应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香水柠檬：产地海南，吉林市市售；无水乙醇（分析纯）：北京化工厂；维生素C（Vitamin C，VC）、TiO2（分析纯）：上海生工生物工程有限公司；柠檬酸、NaOH（分析纯）：西陇化工股份有限公司；山梨酸钾（食品级）、可溶性淀粉（食品级）、氯化钠、葡萄糖、β-环胡精、聚乙二醇、AgNO3：国药集团化学试剂有限公司；MgSO4、KCl（分析纯）：麦克林公司；Al（NO3）3（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；FeSO4（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；FeCl3（分析纯）：阿拉丁有限公司。

1.2 仪器与设备

DK-S26数显恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；MS-H-Pro磁力加热搅拌器：大龙兴创实验仪器有限公司；UV-2700紫外分光光度计：日本岛津公司；QUINITIX124-1CN电子精密分析天平：德国赛多利斯有限公司；KQ-800KDE高功率超声波清洗仪：昆山舒美超声仪器有限公司；ZN多功能粉碎机：中南制药机械厂；202-1型电热恒温鼓风干燥箱：天津泰森仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香水柠檬果皮绿色素的前处理及提取工艺

参考文献[11]，将新鲜的香水柠檬洗净后剥皮，将皮切成碎片后经60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛后备用。称取一定量的香水柠檬果皮样品，加入一定量的提取剂超声辅助提取，3 000 r/min离心10 min，取上清液过滤后即为香水柠檬果皮绿色素提取液。

1.3.2 香水柠檬果皮绿色素最佳吸收波长的确定

精确称取0.5 g香水柠檬果皮粉末，加入体积分数为70%的乙醇溶液25 mL，在480 W功率下进行超声波辅助提取45 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液定容至25 mL，以提取溶剂作为空白对照，在300 nm～800 nm波长处测定绿色素的吸光度，确定香水柠檬果皮绿色素的最佳吸收波长。

1.3.3 单因素试验

以香水柠檬果皮绿色素吸光度值为指标，在固定提取条件下考察提取时间、提取功率、乙醇体积分数和液料比对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响。提取时间分别为 15、30、45、60、75、90 min，提取功率分别为320、400、480、560、640W，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%，液料比分比为15∶1、30 ∶1、45 ∶1、60 ∶1、75 ∶1、90 ∶1（mL/g）。其中固定提取条件为：提取时间45 min、提取功率480 W、乙醇体积分数70%以及液料比45∶1（mL/g），每克香水柠檬果皮的提取液定容至100 mL后检测吸光度值。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取提取时间、提取功率、乙醇体积分数和液料比4个因素，采用Box-Behenken试验设计，进行四因素三水平试验，试验因素水平表如表1所示。

表1 试验因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.3.5 香水柠檬果皮绿色素稳定性研究

按优化的工艺提取香水柠檬果皮绿色素，每克香水柠檬果皮绿色素提取液定容至60 mL。按照下列步骤检测不同条件对绿色素稳定性的影响。

1.3.5.1 温度对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

精确吸取香水柠檬果皮绿色素粗提取液5 mL分别在 4、20、40、60、80、100 ℃条件下处理 0、30、60、90、120、150、180 min，观察香水柠檬果皮绿色素色泽变化，并在波长415 nm处测定吸光度值。

1.3.5.2 光照对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

精确吸取香水柠檬果皮绿色素粗提取液5 mL，分别置于避光、室内自然光和日光直射处放置0、2、4、6、8、10、12、14 d，观察香水柠檬果皮绿色素色泽变化，并在波长415 nm处测定吸光度值。

1.3.5.3 常用食品添加剂对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

精确吸取香水柠檬果皮绿色素粗提取液5 mL，分别加入0.05 mol/L山梨酸、可溶性淀粉、柠檬酸、葡萄糖、β-环胡精、VC、氯化钠和聚乙二醇溶液各5 mL，经漩涡混匀器摇匀后，室温处理60 min，观察香水柠檬果皮绿色素色泽变化，并在波长415 nm处测定吸光度值，以等体积含有食品添加剂的溶液在0 min时测定的吸光度为对照。

1.3.5.4 金属离子对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

精确吸取香水柠檬果皮绿色素粗提取液5 mL，分别加入 0.05 mol/L Mg2+、K+、Ti4+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ag+和Na+溶液各5 mL，经漩涡混匀器摇匀后，室温处理10 h，观察香水柠檬果皮绿色素色泽变化，并在波长415 nm处测定吸光度值，以等体积含有金属离子的溶液在0min时测定的吸光度为对照。

2 结果与分析

2.1 香水柠檬果皮绿色素最大吸收波长的选择

香水柠檬果皮绿色素吸收光谱见图1。

图1 香水柠檬果皮绿色素吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

从图1可知，香水柠檬果皮绿色素在415 nm和666 nm处均有明显吸收峰，其中在415 nm处峰值最高，故选415 nm为测定香水柠檬果皮绿色素吸光度值的检测波长。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对香水柠檬果皮绿色素提取的影响

提取时间对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响见图2。

图2 提取时间对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由图2可知，随着提取时间的延长，绿色素溶液吸光度值不断增大，只是因为超声处理的时间延长、细胞破碎的程度增大后，细胞内部的绿色素物质开始向外扩散，使溶剂中的绿色素含量迅速上升。当提取时间为60 min时，色素溶液吸光度值达到最大值。当提取时间继续延长时，绿色素溶液吸光度值反而下降，这表明60 min时香水柠檬果皮绿色素已提取完全，而随着绿色素在空气中暴露的时间延长，导致部分绿色素降解氧化，造成绿色素含量下降。而且提取时间过长，乙醇容易挥发，溶剂与原料的接触也不十分充分，绿色素不能完全溶出，提取率相应降低。因此选取60 min为最佳提取时间进行后续试验。

2.2.2 提取功率对香水柠檬果皮绿色素提取的影响

提取功率对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响见图3。

图3 提取功率对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction power on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由图3可知，随着提取功率的增大，绿色素吸光度值呈现先上升后下降的趋势，并在提取功率为560 W时达到最大。当提取功率超过560 W时，绿色素吸光度值反而降低。增大超声波功率强化传质同时使细胞的破碎程度增加，从而有利于绿色素的提取[12-13]。但当超声波功率过大时，会引起绿色素结构被破坏或降解。因此，选取560 W为最佳提取功率进行后续试验。

2.2.3 乙醇体积分数对香水柠檬果皮绿色素提取的影响

乙醇体积分数对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由图4可知，随着乙醇体积分数的升高，绿色素溶液吸光度值逐渐升高，但在70%之后逐渐下降。这可能与绿色素中叶绿素的亲水基团有关。当乙醇体积分数达到70%时，亲水基团基本与水结合并充分溶解于水中。当乙醇中的水分含量越低，绿色素分子的亲水基团不易与蛋白质分离，不利于绿色素从类囊体膜中游离出来，亲水基团与水结合的能力相应降低，提取效果随之降低[14]。因此，选取70%的乙醇体积分数为最佳液料比进行后续试验。

2.2.4 液料比对香水柠檬果皮绿色素提取的影响

液料比对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响见图5。

图5 液料比对香水柠檬果皮绿色素提取效果的影响Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由图5可知，随着液料比增加，乙醇渗透细胞膜的效果越明显，超声波对细胞的作用越强，利于绿色素从细胞中分离进入提取溶剂中，因而提取效果也越好，绿色素溶液吸光度值越高。当液料比为45∶1（mL/g）时，绿色素萃取的比较完全，当液料比继续增加后，绿色素提取效果逐渐降低，吸光度值逐渐下降。而且，液料比太大，增加了浓缩操作的困难，浪费能源[15]。综合考虑，为节约生产成本，选取 45∶1（mL/g）为最佳液料比进行后续试验。

2.3 香水柠檬果皮绿色素提取条件的优化

由图2～图5可知，在不同提取时间、提取功率、乙醇体积分数、液料比下，香水柠檬果皮绿色素的提取效果均存在差异，故而在单因素试验的基础上，根据Box-Benhken的中心组合试验设计原理，选取提取时间A、提取功率B、乙醇体积分数C、液料比D作为4个因素，并以绿色素提取液吸光度作为响应值，试验方案及结果见表2。

对数据进行回归分析，获得回归方程：Y=0.44+0.01A+0.03B+0.019C+0.017D+0.008 5AB+0.02AC-0.000 25AD+0.007 5BC-0.028BD-0.11CD-0.014A2-0.029B2-0.017C2-0.012D2。为验证方程的有效性，对上述结果进行数据分析，方差分析结果见表3。响应值的可信度分析的模型相关系数R2=0.908 6，接近于1，表示模型相关度很好。校正系数R2Adj=0.817 2，该模型能解释81.72%响应值的变化，因而该模型拟合程度比较好。变异系数C.V.=3.75%，说明该数学模型的置信度较好，可以用此模型对超声提取香水柠檬果皮绿色素进行分析和预测。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken analysis

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

续表3 回归方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of the regression equation

由表3可知，该模型的F值为9.940 921，P值＜0.000 1，判断该模型是极显著的；响应值的模型失拟项P=0.352 5，说明模型失拟项不显著。综上所述，该模型对绿色素溶液吸光度值的拟合程度好，试验误差小。该试验中4个单因素对绿色素提取效果的影响排序为提取功率＞乙醇体积分数＞液料比＞提取时间。模型方程回归系数和显著性检验结果表明，模型一次项B、C、D 极显著，A 显著；二次项 B2极显著，A2、C2显著，D2不显著；交互项BD极显著，AC显著，AB、AD、BC、CD不显著。因此各个具体试验因素与响应值都不是线性关系。

提取时间、提取功率、乙醇体积分数和液料比的交互作用对香水柠檬果皮绿色素提取的影响响应面图见图6。

图6 提取时间、提取功率、乙醇体积分数和液料比的交互作用对香水柠檬果皮绿色素提取的影响响应面图Fig.6 The response surface figure of effects of extraction time，extraction power，ethanol concentration，and liquid-solid ratio on the extraction of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

图6a表示提取功率和提取时间对绿色素提取的影响，随着提取功率和提取时间的上升，绿色素吸光度呈先增加后下降的趋势，但交互作用不大。图6b表示乙醇体积分数和提取时间交互作用对绿色素提取的影响，随着乙醇体积分数和提取时间的增加，绿色素吸光度呈先增加后降低的趋势，两者交互作用显著。随着乙醇体积分数的增加，绿色素吸光度值上升，但乙醇体积分数达到一定比例后，绿色素吸光度值变化不大。这可能与绿色素本身特性有关。乙醇体积分数过高，可能使极性较大的物质无法溶出，因而绿色素的吸光度值下降。延长提取时间，在一定范围内可以得到较高的绿色素吸光度值。图6c表示液料比和提取时间交互作用对绿色素提取的影响，随着液料比和提取时间的增加，绿色素吸光度值变化不大，呈现先增加后降低的趋势，但其交互作用不显著。图6d表示乙醇体积分数和提取功率交互作用对绿色素提取的影响，随着乙醇体积分数和提取功率的增加，绿色素吸光度值先增加后降低，但其交互作用不显著。乙醇体积分数对绿色素提取的影响高于提取功率对绿色素提取的影响。图6e表示液料比和提取功率交互作用对绿色素提取的影响，随着液料比和提取功率的增加，绿色素吸光度值先升高后降低，且交互作用非常显著。增加液料比和提取功率，在一定范围内可得到较高的绿色素吸光度值。图6f表示液料比和乙醇体积分数交互作用对绿色素的影响，随着液料比和乙醇体积分数的增加，绿色素吸光度值先逐渐升高后逐渐降低，但交互作用不显著。

以提取时间、提取功率、乙醇体积分数和液料比为考察因素，以吸光度值为响应值，经Desigh Expert 8.0.6软件分析可得最佳工艺条件为提取时间75 min，提取功率639.53 W，乙醇体积分数80%，液料比31.17∶1（mL/g），相应的响应面二次模型预测绿色素吸光度最大值为0.466。为了试验操作方便，本研究选取提取功率640 W和液料比31∶1（mL/g）为试验条件进行验证试验。在最佳条件下重复3次试验，得到果皮中绿色素的吸光度均值为0.459，与回归方程预测的数值相似，说明香水柠檬果皮绿色素的提取工艺准确可行，在此条件下提取绿色素进行以下试验。

2.4 香水柠檬果皮绿色素稳定性结果分析

2.4.1 温度对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

温度对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响见表4。

表4 温度对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响Table 4 Effect of temperature on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表4可知，4℃～60℃范围内处理0 min～180 min，提取的绿色素吸光度值逐渐降低，颜色由黄绿色变为淡黄色，绿色素提取后处理的时间越长，降解失活的越多，因此颜色逐渐变淡。而100℃处理后，随着处理时间的延长，绿色素吸光度值逐渐升高，这可能与高温状态下，溶剂不断蒸发，而绿色素出现浓缩有关。结果表明，提取的绿色素可在常温条件下保存。

2.4.2 光照对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

光照对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响见表5。

表5 光照对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响Table 5 Effect of light on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表5可知，随着室内自然光和日光照射时间的延长，绿色素的吸光度值逐渐降低，颜色由黄绿色逐渐变成淡黄色。照射处理2天时，日光照射后绿色素的吸光度值显著低于室内自然光照射后绿色素的吸光度值。光照处理14天后，避光处理的绿色素吸光度值略有降低，但降低的不十分明显，而室内自然光照射和日光照射处理的绿色素吸光度值降低显著。结果表明绿色素在避光条件下保存，可避免降解，而在接触日光的条件下，绿色素容易降解，不利于保存。

2.4.3 常用食品添加剂对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

常用食品添加剂对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响见表6。

表6 常用食品添加剂对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响Table 6 Effect of food additives on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表6可知，提取的绿色素中加入不同的食品添加剂处理后，绿色素的吸光度值几乎无变化，颜色也为黄绿色。说明食品添加剂对提取的绿色素影响不大。

2.4.4 金属离子对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响

金属离子对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响见表7。

表7 金属离子对香水柠檬果皮绿色素稳定性的影响Table 7 Effect of metal ions on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表7可知，Mg2+和Ag+使绿色素由黄绿色变成淡黄色，Al3+使提取的绿色素由黄绿色变为淡黄色沉淀，吸光度值变化较大。Fe2+和Fe3+使绿色素由黄绿色变为深黄色。K+、Ti4+和Na+对绿色素的稳定性无影响。

3 结论

研究超声辅助提取香水柠檬果皮中绿色素的工艺，结果表明以乙醇为提取溶剂，提取时间75 min，提取功率 640 W，乙醇体积分数 80%，液料比 31∶1（mL/g）条件下，提取的绿色素含量最高，效果最佳。在此条件下，提取的绿色素吸光度均值为0.459。稳定性试验表明，保存温度对绿色素由一定的影响，温度越高，绿色素的稳定性越差。光照条件下会降低绿色素的稳定性，避光条件有利于绿色素的保存。Al3+、Fe2+和Fe3+对绿色素的稳定性影响较大。