王新明，吕长鑫，*，芦宇，纪秀凤，巴俊文，李思逸，王维民，赵玉梅

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.大连中超食品有限公司，辽宁大连116400；3.朝阳本色有机食品有限公司，辽宁朝阳122000）

红树莓（red respberry）又称托盘、悬钩子、覆盆子和红马林等，为蔷薇科悬钩子属多年生落叶小灌木型果树[1]。果实色泽艳丽、干爽多汁、风味独特，富含水杨酸、鞣花酸、黄酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多种保健成分[2]，被誉为“黄金水果”，并被列为“第三代水果”[3]。近年来，我国红树莓加工业是一种迅速崛起的新兴产业，主要集中于饮料、果酒和罐头制品的加工。随着红树莓可食用部分的生产加工，大量红树莓籽作为加工副产物尚未得到有效利用[4-5]。研究表明，红树莓籽约占红树莓鲜果的10%，籽中含有油脂、花青素、多酚和黄酮等有益成分[6]。红树莓籽中油脂含量较高且红树莓籽油中不饱和脂肪酸和人体必需脂肪酸含量丰富，主要为亚油酸和亚麻酸，具有抗氧化、消炎和预防疾病等功能[7]。故将红树莓籽油开发为营养保健产品，将会有广泛应用前景。植物油脂提取方法较多，如索氏抽提法、有机溶剂萃取、超声波法、微波法和超临界CO2萃取等，这些提取方法操作繁琐且存在有机溶剂残留，故存在一定缺陷。水酶法是利用蛋白酶、果胶酶和纤维素酶等来破坏油料种子的脂蛋白和细胞壁，使油脂从植物细胞中释放出来[8]。水酶法具有工艺简单、条件温和、无溶剂残留和绿色安全等特点[9]。因此，本研究拟采用响应面优化水酶法提取红树莓籽油的工艺，以期为提取红树莓籽油的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓籽：大连中超食品有限公司；Alcalase2.4 L碱性蛋白酶（酶活力2.4AU-A/g）（生物制剂）：诺维信生物技术公司；氢氧化钠、柠檬酸钠（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

Centrifuge5804R冷冻离心机：德国艾本德股份公司；GT-100震动球磨仪：北京格瑞德曼有限公司；SHA-2冷冻水浴恒振荡器：金坛市瑞华仪器有限公司；DHG-9070A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；PL303型电子天平、FiveEasy Plus pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 工艺流程

1.4 试验方法

1.4.1 操作要点

去除红树莓籽中杂质、洗净、恒温干燥后，粉碎过60目筛，称取一定质量红树莓籽置于锥形瓶中，加入一定体积蒸馏水，45℃预热1 h，调节pH值后加入碱性蛋白酶，一定温度酶解反应后90℃水浴灭酶10 min，6 000 r/min条件下离心10 min，收集上层油脂干燥至恒重，得到红树莓籽油。

1.4.2 红树莓籽油提取得率计算

红树莓籽油提取得率按下式计算：

式中：W为树莓籽油提取得率，%；m1为锥形瓶和瓶内红树莓籽油质量，g；m2为锥形瓶质量，g；m为红树莓籽粉质量，g。

1.4.3 红树莓籽油提取单因素试验

1.4.3.1 酶添加量对红树莓籽油提取得率影响

分别称取5份过筛红树莓籽粉30 g于250 mL锥形瓶中，在料液比 1 ∶5（g/mL）、pH 8.0、酶解时间 4 h、酶解温度45℃的条件下，分别考察碱性蛋白酶添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时对红树莓籽油提取得率的影响。

1.4.3.2 料液比对红树莓籽油提取得率影响

分别称取5份过筛红树莓籽粉30 g于250 mL锥形瓶中，在酶添加量1.5%、pH 8.0、酶解时间4 h、酶解温度 45℃条件下，分别考察料液比为 1∶3、1∶4、1∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL）对红树莓籽油提取得率的影响。

1.4.3.3 酶解pH值对红树莓籽油提取得率影响

分别称取5份过筛红树莓籽粉30 g于250 mL锥形瓶中，在料液比1∶5（g/mL）、酶添加量1.5%、酶解时间4 h、酶解温度45℃条件下，分别考察酶解pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 时对红树莓籽油提取得率的影响。

1.4.3.4 酶解时间对红树莓籽油提取得率影响

分别称取5份过筛红树莓籽粉30 g于250 mL锥形瓶中，在料液比1∶5（g/mL）、酶添加量1.5%、pH 8.0、酶解温度45℃的条件下，分别考察酶解时间为2、3、4、5、6 h时对红树莓籽油提取得率的影响。

1.4.4 红树莓籽油提取响应面优化试验

在单因素试验基础上，利用Design Expert 8.0.6.1软件的Box-Behnken设计，以红树莓籽油提取得率（Y）为响应值，酶添加量（A）、料液比（B）、酶解 pH 值（C）及酶解时间（D）为因素，因素水平表见表1。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 酶添加量对红树莓籽油提取得率影响分析

碱性蛋白酶添加量对红树莓籽油提取得率影响如图1所示。

图1 酶添加量对红树莓籽油提取得率的影响Fig.1 Effects of enzyme dosage on the extraction rate of red raspberry seed oil

酶添加量为0.5%～2.0%时，提取率逐渐增加，这是因为蛋白酶对脂蛋白等复合体具有降解作用，酶与底物作用进入脂质体内，对细胞结构进一步破坏，并对脂蛋白进行分解，增加红树莓籽油料组织内油脂流动性，从而有利于油脂释放[10]；酶添加量为2.0%时，提取得率最高；酶添加量大于2.0%后，提取得率略微下降，这是由于随着酶添加量增加，酶与红树莓籽内蛋白结合达饱和状态，酶作用受限，且酶作为一种蛋白质，对油脂有吸附作用，导致红树莓籽油提取得率下降[11]。因此，选择适宜酶添加量为2.0%。

2.1.2 料液比对红树莓籽油提取得率影响分析

料液比对红树莓籽油提取得率影响如图2所示。

料液比为 1 ∶3（g/mL）～1 ∶6（g/mL）时，提取得率逐渐增加，是因为适量水作为提取油脂过程中反应介质，对酶解反应具有促进作用[12]，且料液比过小，底物浓度较大，不利于酶对底物作用；料液比为1∶6（g/mL）时提取得率最高；料液比高于1∶6（g/mL）时，提取得率下降，由于料液比过大，底物浓度和酶浓度均较低，降低了酶反应速度[13]。因此，选择适宜料液比为1∶6（g/mL）。

图2 料液比对红树莓籽油提取得率的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of red raspberry seed oil

2.1.3 酶解pH值对红树莓籽油提取得率影响分析

酶解pH值对红树莓籽油提取得率影响如图3所示。

图3 pH值对红树莓籽油提取得率的影响Fig.3 EffectofpHvalueonextractionrateofredraspberryseedoil

pH 6～8时，提取得率逐渐增加；pH 8时，提取得率最高，这是因为Alcalase2.4 L碱性蛋白酶最适pH值接近8，此条件下酶活高，酶对底物作用效果明显，红树莓籽油提取得率最高[14]；当pH值高于8时，提取得率逐渐下降。因此，选择适宜提取pH值为8。

2.1.4 酶解时间对红树莓籽油提取得率影响分析

酶解时间对红树莓籽油提取得率影响如图4所示。

图4 酶解时间对红树莓籽油提取得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

酶解时间为2 h～4 h时，提取得率逐渐增加；酶解时间为4 h时提取得率最高，是因在适宜酶解时间内，细胞壁结构被破坏，酶解作用完全，提取得率最高；酶解时间大于4 h时，红树莓籽油提取得率趋于稳定，由于反应达到一定时间时底物减少，提取得率趋于恒定，且酶解时间过长会增加能耗，对油品质也有不利影响[15]。因此，选择适宜酶解时间为4 h。

2.2 红树莓籽油提取响应面优化试验

2.2.1 响应面模型建立及显著性分析

根据单因素试验基础，采用Box-Behnken设计模型优化红树莓籽油提取工艺，以红树莓籽油提取得率（Y）为响应值，考察酶添加量（A）、料液比（B）、酶解 pH值（C）和酶解时间（D）对红树莓籽油提取得率的影响，试验结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

对表2中试验数据进行回归拟合，得到二次多项回归方程为：Y=6.27-0.019A+0.1B+0.11C-0.051D-0.033AB-0.32AC-0.017AD+0.31BC+0.097BD+0.28CD-0.52A2-0.62B2-0.93C2-0.23D2。该模型方差分析见表3，模型 p＜0.000 1，失拟项 p=0.465 2＞0.05，模型极显著，失拟项不显著，说明可用此模型对试验进行分析和预测；R2=0.911 3，说明该回归方程拟合度较好；CV=4.67%，说明其置信度较高；信噪比RSN=10.401，模型可调整确定系数R2Adj=0.825 5，说明数据有较高可靠性。由F值可知，4个考察因素对红树莓籽油提取率影响依次为：C＞B＞D＞A。模型中 A2、B2、C2对红树莓籽油提取率影响极显著，AC、BC、CD、D2影响显著，其余项为不显著。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the established regression model

续表3 方差分析表Continue table 3 Analysis of variance for the established regression model

2.2.2 响应面各因素间交互作用分析

图5～图10为不同变量交互作用对提取得率影响的响应面图。在固定酶添加量（A）、料液比（B）、酶解pH值（C）和酶解时间（D）其中两因素的条件下，红树莓籽油提取得率分别随着各因素的增加而增加，达到最大值后随各因素的增加而降低。响应面图可以直观反映各变量对响应值的影响，等高线图形状可以反映出各因素间交互作用强弱。在三维空间响应面图中，其曲面坡度陡峭表明对红树莓籽油提取得率影响显著，反之平缓则不显著。等高线图中，其线性呈椭圆或趋向椭圆，表明对红树莓籽油提取得率影响显著，呈圆形则不显著。并且椭圆排列越密集，说明在两因素变化时，对响应值影响越大，越接近椭圆形区域中心，红树莓籽油提取得率越高，越远离椭圆形区域中心，红树莓籽油提取得率越低[16]。

图5 酶添加量与pH值对红树莓籽油提取得率的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage and pH value on extraction rate of red raspberry seed oil

图5a～图5b为确定料液比和酶解时间基础上，考量酶添加量与酶解pH值对红树莓油提取得率影响关系。图5a表明，当酶解pH值不变时，随着酶添加量增加，红树莓油提取得率先增加后降低；同理，当酶添加量不变时，红树莓油提取得率随酶解pH值变化有类似趋势。酶添加量与酶解pH值对红树莓油提取得率影响显著，曲面较陡。其交互作用等高线图呈椭圆形，响应面图陡峭，且P＜0.05说明两因素交互作用影响显著。

图6 料液比与pH值对红树莓籽油提取得率的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and pH value on extraction rate of red raspberry seed oil

图6a～图6b为确定酶添加量和酶解时间基础上，考量料液比与酶解pH值对红树莓籽油提取得率影响程度。图6a表明，当酶解pH值不变时，随着料液比增加，红树莓籽油提取得率先增加后降低；同理，当料液比不变时，红树莓籽油提取得率随酶解pH值变化有类似趋势。原因可能是随料液比增加，水作为提取剂，将红树莓籽中易溶于水的物质提取出来，从而不利于红树莓籽油的提取；随酶解pH值增大，使碱性蛋白酶活性逐渐降低，不利于红树莓籽油溶出。酶添加量与酶解时间响应面图曲面较陡，等高线图呈椭圆形，且P＜0.05说明两因素交互作用影响显著。

图7 pH值与提取时间对红树莓籽油提取得率的影响Fig.7 Effect of pH value and extraction time on extraction rate of red raspberry seed oil

图7a～图7b为固定酶添加量和料液比时，酶解时间与酶解pH值对红树莓油提取得率的影响。图7a表明，当酶解pH值不变时，随着料液比增加，红树莓油提取得率先增加后降低；同理，当酶解时间不变时，红树莓油提取得率随酶解pH值的变化有类似趋势。酶解时间对红树莓籽油提取得率影响不太显著，曲面较平缓；酶解pH值对红树莓籽油提取得率影响显著，曲面较陡；两因素交互作用等高线图呈椭圆形，响应面图较陡峭，且P＜0.05说明两因素交互作用影响显著。

图8 酶添加量与料液比对红树莓籽油提取得率的影响Fig.8 Effect of enzyme dosage and solid-liquid ratio on extraction rate of red raspberry seed oil

图9 酶添加量与提取时间对红树莓籽油提取得率的影响Fig.9 Effect of enzyme dosage and enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

图8等高线图相对偏圆，响应面图较陡，但P=0.797 4＞0.05，为不显著；图9～图10中各因素交互作用等高线图近似圆形，响应面图曲线较平缓，且P＞0.05说明各因素交互作用不显著；结合P值可知各因素对红树莓籽油提取得率影响依次为：AC＞BC＞CD＞BD＞AB＞AD，其中 AC、BC、CD 交互作用显著，BD、AB、AD交互作用不显著。由图5～图10可知，当其它因素取零水平时，随着酶添加量、料液比、酶解pH值和酶解时间单一变量增大，红树莓籽油提取得率呈先升高后降低趋势，故在选择各因素参数范围内均存在极值，可对红树莓籽油提取最佳工艺进行预测。

图10 料液比与提取时间对红树莓籽油提取得率的影响Fig.10 Effect of solid-liquid ratio and enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

2.2.3 验证试验结果分析

由回归方程求解得出红树莓籽油提取最佳工艺条件为料液比1∶5.46（g/mL）、酶添加量1.9%、提取时间3.88 h、pH 7.28，预测红树莓籽油提取得率在此工艺条件下为6.27%。为验证响应面法优化工艺结果可靠性，进行3组平行验证试验，考虑实际操作条件，将预测最优工艺参数调整为料液比1∶5.5（g/mL）、酶添加量1.9%、提取时间3.9 h、pH 7.3，结果显示红树莓籽油提取得率的平均值6.25%，与预测值相差0.31%，证明结果可信度较高，可有效对水酶法提取红树莓籽油工艺进行优化及分析预测。

3 结论

本试验选取加工副产物红树莓籽为原料，利用水酶法提取红树莓籽油。通过单因素试验和响应面试验确定水酶法提取红树莓籽油最佳工艺条件为：料液比1 ∶5.5（g/mL）、酶添加量 1.9%、提取时间 3.9 h、pH 7.3，红树莓籽油提取得率预测值6.27%，实际值6.25%，响应面模型与实际拟合良好，在实际应用中具有一定参考价值。