许新月　崔文玉　柏雨岑　王文亮　杨正友　王延圣

摘要：高血压疾病严重危害人类健康，ACE抑制肽易被人体吸收且降血压效果好，现正逐渐应用于该类疾病的调控。我国食用菌资源丰富、种植量大，其中提取得到的ACE抑制肽毒副作用小、安全性高，现已成为重要研究热点领域。本研究从食用菌ACE抑制肽的作用机制、提取与分离鉴定、活性检测以及构效关系等方面进行综述，以期为进一步开展研究奠定基础。

关键词：食用菌;ACE抑制肽;高血压;制备;功能活性

中图分类号：S646.099文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）11-0157-05

Research Progress of Preparation and Functional Activity of

ACE Inhibitory Peptides from Edible Fungi

Xu Xinyue1， Cui Wenyu1， Bai Yucen2， Wang Wenliang1， Yang Zhengyou3， Wang Yansheng1

（1. Institute of Agro-Food Science and Technology， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，China;

2. China Rural Technology Development Center， Bejing 100048， China;

3. College of Life Sciences， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract Hypertensive diseases is a serious hazard to human health. ACE inhibitory peptides can be easily absorbed by human body and have a good blood pressure lowering effect， which gradually being applied to the regulation of such diseases. Chinas edible fungi are rich in resources and large in planting amount， from which， the extracted ACE inhibitory peptide was small toxic and side effects and high safety， so it has become an important research hotspot. In this study， the action mechanism， extraction and isolation， activity detection and structure-activity relationship of edible ACE inhibitory peptides were reviewed in order to lay foundations for further research.

Keywords Edible fungus; ACE inhibitory peptide; Hypertension; Preparation; Functional activity

全球十大死亡原因中頭号死亡杀手为心血管疾病。中国心血管患病人数约2.9亿，其中高血压患者占比最大，且年轻化趋势明显[1]。高血压疾病的发病因素不同，但原发性高血压可以借助食物中的某些蛋白质及多肽来进行调控。食物中能起到降血压作用的蛋白质及多肽被称为血管紧张素转换酶（ACE抑制肽）[2]。ACE通过将血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ引起血管收缩，进而使血压升高，ACE抑制肽就是通过抑制血管紧张素的转换过程来降低血压[3]。

我国食用菌产量连年增长，种类繁多，资源丰富。近年的研究发现，食用菌中的功能活性成分可对人体健康产生积极影响，特别是在降血压、抗氧化等方面表现突出。目前，科研人员已证实该活性成分为ACE抑制肽，并对多种食用菌中该物质含量、功效以及提取方法进行了研究[4]。本研究从食用菌源ACE抑制肽的作用机制、制备工艺、活性检测以及构效关系等方面进行综述，以期为进一步研究和开发该物质提供参考。

1 ACE抑制肽的作用机制

生物体的血压调节机制从肾素-血管紧张素系统（RAS）中的血管紧张素元开始。血管紧张素元在肾素的作用下转化成血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转换酶（ACE）的作用下转化成血管紧张素Ⅱ进而引起血管收缩，同时引起醛固酮的释放，作用于远曲小管和集合管，使其增加对Na+和水的吸收，引起血压升高[5]。在激肽释放酶-激肽系统（KKS）中，激肽原在激肽释放酶的作用下转化成激肽，而激肽在ACE的作用下转化成无活性片段使血管收缩、血压升高，而 ACE抑制肽能够将形成的激肽转变成缓激肽进而降低血压[6]。

2 食用菌ACE抑制肽的提取与分离鉴定

2.1 提取方法

2.1.1 水提法 该法是提取食用菌中ACE抑制肽的常用方法[7-11]。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质或肽类稳定性好，溶解度大。用水提法提取ACE抑制肽时，应注意控制料水比、pH值和温度等因素，从而显著提高得率[10，11]。研究者多以大白口蘑[7]、蟹味菇[8]、茶树菇[9，10]、灵芝[11]等栽培食用菌和灰树花、双色牛肝菌等野生食用菌为原料，采用水提法得到ACE抑制肽粗提物后进行分离提纯，所得ACE抑制肽提取率较高，降血压效果理想。

2.1.2 硫酸水解法 该法属于酸水解法的一种，是利用不同样品中蛋白质等电点的不同，通过使用硫酸等试剂将样品溶液调至所需蛋白的等电点附近形成沉淀后析出的方法[11，12]。Zhang等[13]以五种蘑菇为原料，采用硫酸水解法制备ACE抑制肽，发现平菇水解物对ACE的抑制效果最好（IC50=64.11 mg/mL）;采用四步纯化法纯化出的ACE抑制肽均表现出良好的抗热、抗酸碱和易于体外消化的特性。

2.1.3 硫酸铵沉淀法 多肽在高浓度盐存在时发生凝聚并析出沉淀，使用高浓度的硫酸铵盐提取ACE抑制肽时，将pH值控制在一定范围内可提高提取率，并通过超滤等操作来分离纯化出ACE抑制肽[14]。Ansor等[15]使用硫酸铵沉淀法制备灵芝中的ACE抑制肽，将沉淀得到的粗蛋白进行反向液相色谱（RP-HPLC）分离ACE抑制肽并检测其活性，结果显示ACE抑制肽抑制率IC50值为1.13 mg/mL。

2.1.4 甲醇提取法 该法属于有机溶剂提取法的一种，可使样品中ACE抑制肽溶解度降低，形成沉淀后析出[16]。Jang等[17]以侧耳菌为原料，以甲醇提取法提取ACE抑制肽，在经过超滤、Sephadex G-25柱层析、连续C18和SCX固相萃取以及反相HPLC纯化后，得到两种纯化的ACE抑制肽，同时对ACE抑制肽的抗血压活性进行了研究，IC50值分别为0.46、1.14 mg/mL，分子量分别为1 622.85、2 037.26 Da，在原发性高血压小鼠体内表现出显著的降血压功效。

2.2 ACE抑制肽的分离鉴定

在进行ACE抑制肽的分离纯化時，通常采用超滤法、凝胶层析法以及高效液相色谱法联用的方式。超滤法是利用超滤膜的孔隙，将不同分子量的物质进行分离[18]。凝胶层析法是利用凝胶颗粒小孔吸附分子质量不同的物质，质量小于凝胶颗粒小孔的被吸附，分子质量大的物质先被洗脱出来，被凝胶吸附的物质后被洗脱，样品得到进一步分离[19]。高效液相色谱法是根据分离物质的疏水性不同，各组分之间相互影响进而能够在分离柱中得到分离[20]。Hatanaka等[21]将两种方法联用，即凝胶层析后的样品进行高效液相色谱分离，对不同峰值的样品收集后进行纯化，得到活性最强的一组分离肽。Geng等[5]在研究松茸和三色雷蘑ACE抑制肽的分离纯化时，先将松茸样品分别使用5 kDa和10 kDa的滤膜进行过滤，再进行ACE抑制率的检测，检测结果显示经过5 kDa过滤后的样品表现出更好的ACE抑制活性，并将过滤后的样品先后通过Mono-Q阴离子交换柱层柱和Superdex peptide凝胶过滤层析，得到的样品与标准蛋白样品进行比对，发现ACE抑制肽的相对分子质量大约是800 Da。

LC-MS/MS是鉴定ACE抑制肽常用的方法之一。Lau等[22]利用该方法鉴定了从不同食用菌中提取得到的8种功能较强的ACE抑制肽，经与其它食用菌中分离的ACE抑制肽对比，发现序列为AHEPVK、RIGLF和PSSNK的肽具有较低的IC50值，分别为63、116、29 mg/mL;序列为AHEPVK和RIGLF的肽是ACE竞争性抑制剂;序列为PSSNK的肽是非竞争性抑制剂，在消化后表现出较高的ACE抑制活性，可以作为生产抗高血压补充剂的理想成分。

3 ACE抑制肽活性检测方法

3.1 体外检测

Cushman等[23]建立的紫外分光光度法是最早也是最广泛使用的ACE抑制肽活性的体外检测方法。它的工作原理是利用血管紧张素Ⅰ的模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）与ACE反应生成马尿酸（血管紧张素Ⅱ的模拟物），后加入ACE抑制肽（可减少马尿酸生成量），加入前、后分别使用紫外分光光度计测定马尿酸生成量，对比分析得出ACE抑制肽的抑制活性。但在实际操作中，使用紫外分光光度计法检测ACE抑制活性，会出现不是因为ACE作用生成的马尿酸，这样多出来的马尿酸会对试验结果产生影响。

高效液相色谱法[24]是在紫外分光光度法的基础上将HHL与马尿酸分离后再进行紫外分光光度检测。选择高效液相色谱分离后的产物再进行紫外分光光度法检测，相对减少试验误差，精确度较高，结果更准确。赵元晖等[25]在该方法的基础上进行改良，进一步减少了马尿酸在紫外228 nm处的检测误差，提高了精确度。

可见光分光光度计法原理为血管紧张素Ⅰ模拟物呋喃丙烯酰三肽（FAPhe-Gly-Gly），在ACE的作用下转化为血管紧张素Ⅱ模拟物氨基酸（FA-Phe，FAP）和二肽（Gly-Gly，GG）。在该过程中加入ACE抑制肽能够抑制血管紧张素Ⅰ模拟物向血管紧张素Ⅱ模拟物的转换，再利用分光光度计检测生成的血管紧张素Ⅱ模拟物的含量来确定ACE活性，依次来推断出ACE抑制肽的抑制率[26]。

何海伦等[27]借助毛细管电泳法简化了传统试验中需要多次进行分光光度计测量的情况，仅需在马尿酸与ACE反应完全后，将样品加入到毛细管中进行电泳分析就可得到试验结果，该试验方法方便快捷。

建议多种检测方法并用，从而尽可能减小不同检测方法可能带来的误差。

3.2 体内活性检测

ACE抑制肽的体内活性检测方法通常使用动物进行活体试验。模型动物一般为原发性或是继发性高血压大鼠。原发性高血压模型是以原发性高血压大鼠为试验对象，检测给药前后大鼠血压的变化来推断ACE抑制肽的活性[28]。继发性高血压模型是以人为手段造成高血压症状的大鼠为试验对象进行短期或长期的观察，给药的方式也分为短期的一次性或者是长期的每天或每周的连续给药[29]。

4 ACE抑制肽功效特性及构象关系

ACE抑制肽通常具有2～12个氨基酸的短链肽。晶体学研究表明任何肽都不能与ACE的活性位点结合。在某些情况下，长链肽具有ACE抑制活性，而氨基酸的类型可能比肽的长度更重要，这与氨基酸组成有关。当肽链中含有高酸性氨基酸（Asp和Glu）时，肽链显示净负电荷，能够与锌原子结合[30]。与锌原子结合后的肽链具有抑制活性，参与哺乳动物的血压调节，分布在哺乳动物身体各处。ACE抑制肽的C末端或N末端具有特定的氨基酸残基，其中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和精氨酸的存在对ACE结合影响很大[31]，C末端具有正电荷的氨基酸也影响肽的抑制作用[32]。

4.1 分子质量的影响

ACE抑制肽的分子质量与抑制效果具有一定相关性。研究人员发现，肽链较短的ACE抑制肽较肽链长的ACE抑制肽有更好的抑制效果[33]。王晶晶[34]发现分子质量小于3 kDa的抑制肽抑制效果最好，大于10 kDa的抑制效果较差。徐克寒等[35]发现ACE抑制肽中分子质量小于1 kDa的抑制肽抑制效果最好。

4.2 氨基酸序列的影响

20世纪70年代，Ondetti等[36]发现ACE抑制肽C端的几个氨基酸对ACE抑制肽的抑制效果有重大影响。当ACE抑制肽的一级氨基酸中大量存在疏水氨基酸，同时C端带有正电荷的氨基酸、N端含有芳香族氨基酸时，ACE抑制肽的抑制活性较高。

4.3 ACE抑制肽结构与抑制率的关系

Liu 等[37]和Pan 等[38]使用模拟分子对接的方法对ACE抑制肽的构效关系进行了研究，发现处在ACE抑制肽中心的氨基酸对ACE抑制肽的效果有重要影响，ACE与ACE抑制肽结合产生作用的位点也不相同。此外，彭剑秋等[39]还利用定量构效关系（quantitative structure activity relationship，QSAR）来进行ACE抑制肽构效关系的研究，进一步补充了抑制肽构效关系。

5 ACE抑制肽研究展望

食用菌源的ACE抑制肽，因其原料易得且降血压效果好正逐渐被大众接受。在相关研究中，ACE抑制肽的具体降血压机制受到多方面的影响，包括ACE抑制肽的来源、提取方式以及活性多肽的结构等。近年来越来越多的研究，使得我们对于食用菌ACE抑制肽有了更加详细的了解，但对于它的具体作用机制尚不明确，仍需进行更加深入的探究。

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收稿日期：2019-07-03

基金项目：山东省自然科学基金（三院联合基金）项目（ZR2016YL029）;山东省农业科学院青年科研基金项目（2016YQN48）;山东省食用菌创新团队产后加工岗位专家项目（SDAIT-07-08）

作者简介：许新月（1995—），女，硕士研究生，研究方向：农产品采后保鲜与加工。E-mail：xuxinyue2018@163.com

通讯作者：王延圣（1988—），男，博士，助理研究员，研究方向：农产品采后保鲜与加工。E-mail：sdnky_wys@163.com