文继锋，申欢欢，阴文奇，龚永平，易可可，邓 英，颜其贵

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

轮状病毒(rotavirus，RV)属于呼肠弧病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus)，被划分为7个不同的群(A～G)[1]。A群轮状病毒是导致幼龄动物腹泻的主要病原之一。幼龄大熊猫感染大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus，GPRV)后，前期会出现食欲废绝、急性呕吐、体温不高等症状，后期发展为水样、蛋花样腹泻，粪便中含有大量的黏液和坏死肠黏膜[2]。GPRV是引起幼龄大熊猫发生非细菌性腹泻的主要病原之一，对圈养大熊猫种群的扩大和健康产生了较大的影响。

RV基因组为分节段的双股RNA，由11个节段组成，每1个节段编码1个蛋白。RV包含6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)。VP7蛋白是由第9基因片段编码，具有型特异性，是诱导机体产生中和抗体最主要的抗原蛋白[3]。VP6蛋白是由第6基因片段编码，是RV的群及亚群抗原。在A群轮状病毒中，VP6蛋白的编码基因高度保守，且VP6蛋白具有良好的抗原性和免疫原性[4]。相关研究表明，VP6蛋白不仅是一种载体蛋白，在稳定结构蛋白VP7的空间结构和增强其免疫原性上起到作用，而且还可以介导黏膜免疫反应，刺激机体产生分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)抗体。

壳寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)又被称为壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是壳聚糖经过特殊的生物酶技术降解得到的聚合度在2～20之间的寡糖产品。壳寡糖的平均分子量为1～3 ku，价格低廉且具有较高的水溶性，易被机体吸收。COS作为一种新型的免疫佐剂，与传统佐剂(油乳、水佐剂)相比，无毒性、生物刺激性小且具有良好的降解性，具有良好的应用价值[5]。相关研究表明，COS能够增强机体的免疫应答水平，并且能够增强亚单位疫苗的免疫效果[6]。同时，由于COS粒径小，具有缓控、释控作用，可有效延长疫苗作用时间，避免突释，减轻或避免毒副反应，提高疫苗免疫效果[7]。本研究以重组表达的GPRV VP6-VP7蛋白为抗原，添加COS作为免疫佐剂，旨在研制一种新型的GPRV亚单位疫苗，并评估该亚单位疫苗的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物

6～8周龄昆明小鼠78只，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 主要试剂

大肠埃希菌表达的重组GPRV VP6-VP7蛋白、GPRV CH-1株由本实验室保存；壳寡糖由山东卫康生物医药有限公司惠赠；氢氧化铝胶佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司；小鼠IgA、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ ELISA试剂盒购自杭州联科生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 疫苗制备

称取壳寡糖1.0 g，充分溶解于450 mL PBS中，定容至500 mL，使得终浓度为2.0 mg·mL-1。取GPRV重组蛋白VP6-VP7(浓度为2.05 mg·mL-1)3.078 mL、壳寡糖溶液2.700 mL倒入装有5.022 mL PBS缓冲液的15 mL离心管中，利用匀浆机充分混匀后，分装保存备用。同时，将重组蛋白GPRV VP6-VP7与氢氧化铝胶佐剂按照1:1混合，充分乳化混匀后分装保存备用。

1.3.2 小鼠免疫试验

取6～8周龄的昆明小鼠78只，随机分为4组，分别为：COS佐剂处理组(A，免疫接种VP6-VP7-COS混合物)、铝佐剂处理组(B，免疫接种VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂混合物)、抗原对照组(PC，免疫接种VP6-VP7蛋白)、阴性对照组(NC，注射PBS溶液)。COS佐剂处理组、铝佐剂处理组、抗原对照组小鼠各24只，阴性对照组小鼠6只，分别于0、15、30 d进行免疫接种。

1.3.3 相关免疫指标检测

在首免后的14、28、42 d，各处理组中随机选取6只小鼠采血，ELISA法检测血清中的VP6-VP7抗体滴度、IgA抗体滴度和细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ的含量。采用MTT法检测T淋巴细胞转化率。

1.3.4 小鼠免疫后攻毒保护试验

在免疫后的第50天，随机选取各处理组小鼠6只，每只小鼠注射GPRV病毒150 μL，注射后连续观察6 d，每天观察并记录小鼠情况。

1.3.5 小鼠免疫后组织病理学分析

在免疫试验的第58天，取每组小鼠注射部位的组织保存于4%多聚甲醛溶液中，然后将组织制作病理切片，采用苏木精—伊红(HE)染色，光学显微镜下观察并记录其病理变化。

2 结果与分析

2.1 小鼠血清IgG、IgA抗体水平

如表1所示，各免疫组小鼠血清中IgG、IgA抗体水平显著(P<0.05)高于PBS组。在免疫后的14、28、42 d，铝佐剂处理组、COS佐剂处理组小鼠的IgG和IgA抗体水平显著(P<0.05)高于抗原对照组；在免疫后的14、28、42 d，COS佐剂处理组小鼠的IgA抗体水平显著(P<0.05)高于铝佐剂处理组。

表1 各组小鼠血清中IgG、IgA抗体滴度的变化

Table1IgG and IgA antibody titers in mice immunized with different vaccines

处理TreatmentIgG14 d28 d42 dIgA14 d28 d42 dA0.934±0.012 b1.243±0.027 b0.954±0.016 a0.291±0.027 a1.138±0.025 a0.982±0.019 aB1.643±0.021 a1.865±0.043 a0.732±0.027 b0.285±0.024 b0.786±0.053 b0.658±0.016 bPC0.412±0.023 c1.116±0.028 c0.543±0.033 c0.156±0.034 c0.184±0.029 c0.161±0.023 cNC0.102±0.015 d0.102±0.015 d0.105±0.013 d0.067±0.002 d0.069±0.006 d0.059±0.004 d

同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

The values in the same line with different lower-case letters showed significant differences (P<0.05). The same as below.

2.2 小鼠脾脏淋巴细胞增殖结果

试验第44天，MTT法检测小鼠脾脏中T淋巴细胞的增殖能力(表2)。VP6-VP7-COS物理混合组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7蛋白组均能诱导小鼠脾脏T淋巴系统的增殖，且与PBS组差异显著(P<0.05)。VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。

表2 各组小鼠脾脏增殖检测结果

Table2Results of spleen proliferation in mice of each group

分组ConANo-ConAA0.282±0.046 b0.150±0.016 aB0.472±0.023 a0.152±0.014 aPC0.184±0.024 c0.146±0.018 aNC0.158±0.022 d0.154±0.011 a

2.3 小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ含量

如图1、2所示，在免疫后的14～42 d，VP6-VP7-COS物理混合组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7组免疫小鼠血清中IL-2、IL-4含量均升高，且显著(P<0.05)高于PBS对照组；VP6-VP7-COS物理混合组和VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠血清IL-2、IL-4含量显著(P<0.05)高于VP6-VP7组；VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠血清中IL-2、IL-4含量显著(P<0.05)高于VP6-VP7-COS物理混合组。

图1 各组小鼠血清IL-2含量的变化Fig.1 Concentration of IL-2 in mice serum of each group

图2 各组小鼠血清IL-4含量的变化Fig.2 Concentration of IL-4 in mice serum of each group

如图3所示，在免疫后的14～42 d，VP6-VP7-COS物理混合组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7蛋白组中免疫小鼠血清中IL-5含量均升高，且显著(P<0.05)高于PBS组。VP6-VP7-COS物理混合组和VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠血清IL-5含量显著(P<0.05)高于VP6-VP7组；在免疫后42 d，VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠血清中IL-5含量下降，且显著(P<0.05)低于VP6-VP7-COS物理混合组。

图3 各组小鼠血清IL-5含量的变化Fig.3 Concentration of IL-5 in mice serum of each group

如图4所示，在免疫后的14～42 d，VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组小鼠血清中IFN-γ含量显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组和PBS对照组。免疫后28～42 d，VP6-VP7蛋白组小鼠血清中IFN-γ水平显著(P<0.05)高于PBS组。在整个免疫期间，VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠血清中IFN-γ水平显著(P<0.05)高于VP6-VP7-COS物理混合组。

图4 各组小鼠血清IFN-γ含量的变化Fig.4 Concentration of IFN-γ in mice serum of each group

2.4 小鼠免疫后攻毒保护试验

每只小鼠接种150 μL GPRV病毒，6 d内观察各组小鼠情况。VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠0～6 d内精神状态正常，食欲正常，未出现死亡； VP6-VP7-COS物理混合组小鼠攻毒后12 h内精神较差，后期正常，食欲正常，6 d内死亡1只，可能是由于疫苗接种过程中疫苗注射遗漏或者小鼠体质原因导致其抗体产生不足；VP6-VP7蛋白组小鼠攻毒后精神较差，后期3只精神较差，其余较好，食欲正常，6 d内死亡2只；PBS对照组小鼠在攻毒后全部死亡。结果表明，VP6-VP7-COS物理混合组和VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组所产生的抗体均能对小鼠提供免疫保护。

2.5 小鼠免疫后组织病理学分析

如图5所示，在免疫期间，PBS对照组、VP6-VP7-COS物理混合组在注射部位均没有出现肉芽肿结节、溃烂等症状，同时病理切片上并没有显示任何炎症反应。VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠在免疫15 d后注射部位出现了明显的肉芽肿性结节，免疫后期注射部位的皮肤出现溃烂，病理切片观察可以看到明显的炎性反应，中性粒细胞渗出，以及有残留的油乳佐剂没有被代谢。综合以上分析表明，与油乳佐剂的副作用相比，壳寡糖作为免疫佐剂在起到免疫增强作用的同时并没有表现出毒副作用。

图5 免疫小鼠组织病理切片结果Fig.5 Histopathological sections of immunized mice

3 讨论

大熊猫轮状病毒主要导致幼龄大熊猫发生传染性腹泻，对于大熊猫种群的扩大会造成一定的影响。目前并没有用于预防大熊猫轮状病毒性腹泻的疫苗。疫苗中的抗原与佐剂经过一定比例混合后，能够更好的增强疫苗的免疫原性。但是，传统佐剂(油乳、水佐剂)在使用过程中存在代谢速度慢，不易被机体充分吸收，注射部位形成肉芽肿、溃疡等问题。因此，开发一种安全无毒副作用，且能够起到免疫增强作用的新型疫苗佐剂，对轮状病毒性腹泻的预防具有重要的意义。壳寡糖可以与机体特定的受体结合激活免疫系统，从而发挥免疫调节作用，已经被证明具有免疫佐剂活性[8]。在轮状病毒结构蛋白中VP6、VP7蛋白可以产生中和抗体，且VP6蛋白也被认为在适当的条件可介导黏膜免疫反应。因此，本研究选用GPRV VP6-VP7作为候选抗原，壳寡糖作为免疫佐剂，免疫小鼠后测定各项免疫指标，评估COS对重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用。

本试验结果表明，GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗提高了小鼠抗GPRV的中和抗体效价，虽然VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组小鼠产生的中和抗体水平要高于VP6-VP7-COS组，但是在通过免疫小鼠的攻毒保护试验后VP6-VP7-COS组免疫小鼠所产生的抗体也能够提供免疫保护。中和抗体水平在评价动物机体特异性抵抗力时有着重要的参考价值。本研究证实COS作为免疫佐剂可以提高重组蛋白VP6-VP7诱导的中和抗体水平，所产生的抗体可以有效地中和GPRV，从而降低其对病毒的感染能力。

壳寡糖具有缓控、释控的能力，可以延缓抗原成分在体内的释放，并且可介导黏膜免疫反应。GPRV VP6蛋白不仅可以产生中和抗体，而且在适当的条件下刺激机体产生sIgA。因此，以壳寡糖作为佐剂的GPRV VP6-VP7蛋白亚单位疫苗在免疫小鼠后血清中IgA抗体的含量显著增高。IL-5可以反应出IgA的表达水平，在本研究中通过对各组免疫小鼠血清中IL-5测定，得出VP6-VP7-COS组中IL-5含量显著增加。综合得出壳寡糖作为免疫佐剂可以有效地刺激机体产生IgA，从而介导机体的黏膜免疫反应。

T淋巴细胞的活性与体液免疫和细胞免疫反应密切相关。在本研究中将ConA作为非特异性刺激剂激活T淋巴细胞后，用以评价各免疫组对小鼠T淋巴细胞的增殖效果。结果显示，在添加寡聚糖后提高了小鼠淋巴细胞的增殖活性，证实寡聚糖可以有效提高机体T淋巴细胞介导的免疫应答水平。

细胞因子参与免疫反应，在抗感染中起着重要作用[9]。Th1细胞产生IFN-γ、IL-2，可以促进细胞介导的免疫应答，其中IL-2可以间接反映细胞的免疫状态。Th2细胞分泌IL-4，介导机体的体液免疫应答。因此，IL-2、IL-4和IFN-γ分泌可以间接反应机体的体液免疫和细胞免疫水平[10]。研究结果显示，以寡聚糖为佐剂的GPRV VP6-VP7蛋白亚单位疫苗所产生IL-2、IL-4和IFN-γ含量低于VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组，VP6-VP7-COS疫苗既可以刺激机体的体液免疫应答也可以刺激其细胞免疫应答。

选取VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂、VP6-VP7-COS物理混合组和PBS对照组小鼠注射部位的肌肉组织进行组织病理学分析，结果显示，VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组的小鼠注射部位出现明显的化脓性溃疡、肉芽肿结节，但是VP6-VP7-COS物理混合组和PBS对照组没有出现病理变化，表明壳寡糖作为佐剂在起到免疫增强作用的同时不会产生毒副作用。综合以上，本研究结果为研制具有安全、无毒副作用和高免疫保护力的GPRV亚单位疫苗提供了研究依据。