马斯霜 白海波 惠建 吕学莲 陈晓军 李树华

摘要：CRISPR/Cas9技术是新发展的定向基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是在细菌和古细菌中发现的1种抵御外来病毒及质粒入侵的获得性免疫系统。CRISPR/Cas9技术由sgRNA（单向导RNA）介导，与Cas9核酸酶切割实现作物定点编辑改良。本文主要对CRISPR/Cas9技术的工作原理、系统分类、结构、系统构建方法进行了系统介绍。同时，总结了CRISPR/Cas9技术在水稻和小麦的突变体库的建立和基因功能研究、品质和农艺性状遗传改良等方面的研究。并对CRISPR/Cas9技术对作物进行定向编辑改良进行了展望，以期为利用CRISPR/Cas9技术创制新品种、作物品种改良提供参考。

关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑;遗传改良;水稻;小麦

中图分类号：Q789 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0029-04

世界人口持续增长、耕地面积减少、生态环境逐步恶化等因素，为粮食的持续性稳定供给增加了风险[1]。对作物进行遗传改良，提高作物的产量、品质、抗逆性以应对人口增长和气候变化是育种人员首要解决的问题[2]。虽然传统育种技术解决上述问题已取得一定效果，但依靠杂交创制新品种，选育稳定优良品种耗时长，成本高，在选择过程中容易造成优良基因的丢失，且遗传相似性较高。分子标记辅助育种（MAS）常因多代回交和连锁累赘而丢失分子标记，影响作物遗传改良的进程。传统的基因编辑技术以基因重组为基础进行基因组定向修饰，但该技术存在脱靶率高、周期长、应用范围窄等缺点。

随着现代生物技术的迅速发展，大量物种的全基因组测序已经完成，为用基因编辑、基因工程等技术对作物进行遗传改良奠定了基础。作物遗传改良已经由常规杂交向定向编辑改良转变。基因编辑可直接对基因组或者转录产物进行定向编辑，通过片段的插入、替换、敲除等定点编辑修饰。基因编辑技术极大地加速了生命科学研究进程[3-4]。基因编辑技术通过模板识别靶位点序列，核酸酶对靶位点切割造成DNA双链断裂（double strand breaks，简称DSBs），以及DSBs 激活DNA损伤修复应答机制，即非同源末端连接（non-homologous ending-joining，简称NHEJ）或同源重组（homologous recombination，简称HR）。NHEJ可在酶切位点发生碱基的插入或缺失;在有同源供体DNA时HR会导致靶位点序列的替换[5-6]。现主要有3种基因编辑技术：锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFNs）、TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，简称TALENs）和CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9）[7]。ZFNs与TALENs技术根据靶位点序列设计识别蛋白模板，FokⅠ内切酶与蛋白模板融合切割;CRISPR/Cas9技术，只需根据靶位点序列设计20个核苷酸的gRNA（向导RNA），Cas9切割DNA[8]。CRISPR/Cas9技术因其简洁的操作、低脱靶率等优点，将基因编辑技术的完善与应用推向了新高潮。

1 CRISPR/Cas9的简介

CRISPR/Cas9是新发展的定向基因编辑技术。由于易操作、成本低且脱靶率低，被Science评为2013年十大科学进展之一[9]。CRISPR/Cas9是在细菌和古细菌中发现的一种抵御外来病毒及质粒入侵的获得性免疫系统[10]。CRISPR/Cas9系统由CRISPR位点、Cas蛋白、编码DNA序列组成，并因操作性强、编辑效率较高等优点，已经被用于小麦、水稻、玉米、拟南芥等植物中。

1.1 CRISPR/Cas9技术的作用原理

细菌和古细菌的CRISPR/Cas9系统抵御外来病毒及质粒侵染的免疫机制有3个阶段[11-13]。首先是外源DNA的获取，外源DNA侵入时，识别PAM区域，邻近PAM的DNA序列作为原间隔序列，蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，通过鉴定、加工整合到CRISPR 位点。其次是crRNA的合成表达阶段，CRISPR在前导区的调控下转录出precursor-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和trans-acting crRNA（tracrRNA），tracrRNA、pre-crRNA和Cas9 蛋白在RNase（核糖核酸酶）的作用下产生crRNA。crRNA通过碱基配对与 tracrRNA 结合形成 tracrRNA/crRNA復合物[14-15]，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。最后是靶向干扰阶段，以上2种RNA复合物被改装成1个向导RNA（single-guideRNA， 简称sgRNA） [16-17]。这个sgRNA与Cas9对DNA双链进行切割，在完整基因组上的特定位点完成切割反应，sgRNA序列还可借助特定软件进行设计。sgRNA和Cas9与外源DNA进行识别，并识别出与crRNA互补的原间隔序列，复合物将被定位到PAM原间隔序列的区域，形成R-Loop[18-19]。Cas9 剪切与crRNA互补的DNA链，双链断裂，形成DNA双链断裂（DSBs）。断裂的双链通过同源重组或非同源末端连接得到修复，从而达到对基因组编辑的目的。

1.2 CRISPR/Cas9分类及结构

细菌和古细菌中存在大量的Cas9蛋白，根据其结构、功能、对应的gRNA 不同等因素可大致分为3类。第1类在成熟的sgRNA中有1个茎环结构，需要与大量的Cas9蛋白形成1个蛋白复合体，可在sgRNA的作用下切割目的DNA片段。在第2类中需要的Cas蛋白较少，其sgRNA有多个茎环结构;该类型是CRISPR/Cas系统中最简单，同时也是编辑效率最高的一类。第3类中Cas9蛋白形成2个不同形式的复合体，分别是Csm复合体和Crm复合体，其中Csm复合体结合sgRNA后切割目的DNA片段，而Crm复合体则可以结合sgRNA后去切割RNA分子。

CRISPR/Cas9系统主要由CRISPR位点、Cas蛋白构成[20]。CRISPR位点主要是由保守的重复序列和长度相似的间隔序列交替排列组成。间隔序列与一些质粒或者噬菌体的序列具有较高的同源性，间隔序列可使宿主细胞免疫外源DNA的入侵，是细菌及古生菌长期进化形成的一种适应性免疫系统。前导序列可以作为启动子，使CRISPR位点的序列开始转录，转录出的RNA被命名为CRISPR RNAs（crRNAs）。Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系统的重要组成部分，Cas9剪切与crRNA互补的DNA链，DNA双链断裂。Cas9由1 409个氨基酸组成，主要有2个大小不同的结构域，是1种多结构域蛋白，主要包括大的球形特异性识别结构域（REC）和小的核酸酶功能域（NUC）;核酸酶结构域又进一步包含2个核酸酶位点RuvC和HNH，以及1个PAM-interacting位点[21]。

1.3 CRISPR/Cas9构建方法

CRISPR/Cas9系统的构建仅包括Cas9蛋白和gRNA的构建。Cas9蛋白和gRNA可分别在2个不同载体中构建，也可同时在1个载体中构建。这2种构建方法各具特点：将Cas9蛋白和gRNA构建在同一载体上可提高转化效率，降低脱靶效率，该方式在转化困难的作物中较为实用。将Cas9蛋白和gRNA分别构建在2个表达载体上，能快速检测脱靶效率[22]。为使Cas9更高效地表达，构建时要对密码子进行优化;gRNA的设计主要根据靶位点的 DNA 序列进行[23]。CRISPR/Cas9的转化效率除了受Cas9和gRNA的构建影响外，还有很多其他因素。通常SNP（单核苷酸多态性）和环的循环越少，gRNA越有效;此外，脱靶效率还与gRNA-DNA杂交体的解链温度具有较高的相关性，并与AT含量与脱靶效应呈负相关，因此AT百分比越高，脱靶效应越低[24]。

2 CRISPR/Cas9技术在水稻遗传改良中的应用

水稻不仅是重要的粮食作物，也是重要的模式植物，相比于小麦复杂的遗传结构背景，CRISPR/Cas9技术在水稻的基因编辑改良中更易操作。CRISPR/Cas9基因编辑技术在水稻基因功能研究、水稻品种改良、水稻突变体库建立等方面表现出巨大的潜力。

2.1 CRISPR/Cas9技术在水稻突变体库建立方面的应用

现代农业发展史中的2次绿色革命，都与突变体的研究密不可分。在自然环境中存在自发突变，但自发突变获得的突变体进行基因功能的研究已经不能满足生物学发展要求，CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学，已经在突变体库的建立方面取得极大进展，进行大规模高通量筛选，为基因组学的研究与农业生产奠定了基础。沈春修等通过CRISPR/Cas9，以粳稻台北309为受体材料，对LOC_Os05g31750位点进行敲除，获得6株成功敲除的突变体植株[25]。沈兰等利用CRISPR/Cas9构建载体，共敲除8个农艺性状，在T0代检测到杂合突变株和纯合突变株[26]。此外，在突变株中发现了纯合的六突突变株、七突突变株、八突突变株。原文霞等利用新的载体和方法，对水稻日本晴D3基因的3个位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体，并获得一系列转基因植株，研究了纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系[27]。杨绍华等利用CRISPR/Cas9对水稻品种明恢86中的Os IPA基因突变体功能进行验证，研究该基因在水稻花粉发育过程中的功能[28]。Mao等利用CRISPR/Cas9对Os MYB1基因进行定向编辑，获得突变体，研究该基因功能[29]。Xie等利用CRISPR/Cas9技术对水稻负调节植物抗病性基因OsMPK5的3个位点分别进行编辑，验证该基因对突变株抗病性的影响[30]。Feng等利用CRISPR/Cas9分别对ROC5（Rice Outermost Cell-specific gene5）、SPP（Stromal Processing Peptidase）、YSA（Young Seedling Albino）3个基因进行编辑，发现不同基因编辑产生的突变体间存在极显著差异[31]。胡雪娇等利用CRISPR/Cas9，以SD1基因为靶基因，研究该基因对突变株系株高的影响[32]。

2.2 CRISPR/Cas9技术在水稻品质改良中的应用

随着人们对植物代谢途径的研究不断深入，利用分子技术对作物品質进行改良也取得显著成效。随着CRISPR/Cas9技术机制的不断阐明，采用CRISPR/Cas9技术进行作物品质定向改良已显现出巨大的潜力。目前，人们利用CRISPR/Cas9已经成功地对水稻进行不同方面的品质改良。冯璇等利用CRISPR/Cas9编辑技术将高产的非糯性品种转为糯性品种，对保持系209B的Wx位点进行定点编辑，并转育糯稻不育系WX209A且直链淀粉含量降低[33]。汪秉琨等利用CRISPR/Cas9编辑Wx基因，获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的转化株系[34]。Zhou等利用CRISPR/Cas9，在应用最广泛的温敏核不育TGMS基因中诱导特异性突变，并开发了新的“转基因清洁”TGMS系，加速了不育系的育种，开发了杂种优势[35]。刘维等通过CRISPR/Cas9技术，以感病品种丽江为材料，对抗病基因OsCOL9进行编辑，丽江抗病性显著增强[36]。邵高能等通过CRISPR/Cas9对中花11的香味基因Badh2进行编辑，突变体材料中的香味物质显著增加[37]。白建江等利用CRISPR/Cas9得到稳定的没有潮霉素标记的高抗性淀粉水稻纯合突变株，为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源[38]。Wang等利用CRISPR/Cas9对粳稻 Kuiku131稻瘟病负调控抗性基因OsERF922进行编辑，发现纯合突变系在苗期和分蘖期稻瘟病发病程度明显比野生型低，且农艺性状没有发生明显的变化[39]。

2.3 CRISPR/Cas9技术在水稻农艺性状改良中的应用

作物品种改良的关键是对农艺性状进行改良，利用控制农艺性状的有利等位基因，通过分子标记辅助育种进行改良。虽然分子标记能够对作物中许多控制重要农艺性状的基因进行定位，但不能对目标性状进行定向改造。CRISPR-Cas9能有目的地选择一些有价值的等位基因在育种中应用。Xu等通过CRISPR/Cas9对粒质量基因GW2、GW5和TGW6同时进行编辑，得到gw5tgw6和gw2gw5tgw6突变体，其粒质量较野生型品种粳稻明显增加，且3个基因间无互作关系[40]。Shen等利用CRISPR/Cas9对4个水稻品种的粒长和穗粒数进行定向编辑，且gs3和gs3nla突变体的粒长和千粒质量较野生型明显增加[41]。韩娇等通过CRISPR/Cas9对水稻中与McPht蛋白同源性最高的磷转运蛋白基因进行编辑，并对突变体进行生理指标测定，水稻突变体的株高、鲜质量、根系活力均小于野生型，根系扫描结果显示，水稻突变体的根长、投影面积、表面积和侧根数均大于野生型[42]。孟帅等利用CRISPR/Cas9编辑控制粒长基因GS3，对后代植株粒型进行考察，gs3突变体的粒长均显著长于野生型[43]。沈兰等利用CRISPR/Cas9，以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为靶基因，转化4个优质水稻品种，突变体gs3和gs3gn1a 与野生型相比粒长变长，千粒质量增加;突变体gs3gn1a与突变体gs3相比，每穗粒数显著增加[44]。Miao等利用CRISPR/Cas9 系统分别研究CAO1和LAZY1基因对突变株叶绿素B的合成和分蘖夹角的影响[45]。Li 等对粳稻Zhonghua11中的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1与产量相关的4个基因编辑，Gn1a、DEP1和GS3纯合突变株穗粒数、直立型密穗数和千粒质量显著增加，且DEP1和GS3突变植株中出现了半矮秆和长芒现象，而IPA1突变株中出现了多蘖和少蘖2种现象[46]。

3 CRISPR/Cas9系统在小麦遗传改良中的应用

小麦是异源多倍体，其基因组较为庞大，高倍性和高度重复的DNA序列使得其正向和反向遗传分析均难以进行。因其复杂的遗传结构、巨大的基因组（17Gb）和对转化的顽固，对小麦基因组进行定点编辑相对困难[47]。近年来，CRISPR/Cas9已经在小麦上广泛应用。利用CRISPR/Cas9对小麦进行遗传改良的研究也广泛开展。Yi等在CRISPR/Cas9的基础上对单个Ta MLO位点进行诱导，获得4个突变体植株，表明CRISPR/Cas9可在多倍体的小麦中诱导形成有利突变[48]。Shan等利用CRISPR/Cas9对控制小麦籽粒形状和分蘖基因Ta GASR7、Ta DEP1定点编辑，纯合敲除突变体的千粒质量和分蘖数明显增加，但株高降低[49]。Liang等在CRISPR/Cas9编辑技术的基础上进行改善，通过粒子轰击传递CRISPR/Cas9的体外转录物（iVts）或核糖核蛋白复合物（rnps）对小麦进行编辑[50]，不仅避免了CRISPR/Cas9随机整合到基因组DNA，还降低了脱靶率，并可在短期内获得再生株系。Bhowmik等将CRISPR/Cas9技术与小孢子技术相结合，并优化了单倍体诱变系统[51]。使用Cas9和sgRNA，对小麦的1个Ds Red外源基因和2个内源基因（Ta Lox2和Ta UbiL1）进行靶向修饰，验证了将小孢子和CRISPR/Cas9基因编辑技术相结合用于作物改良的可行性。Liang等利用基因枪粒子轰击技术分别将7个不同目的基因的CRISPR/Cas9 的DNA分别导入到二倍体硬质小麦和六倍体面包小麦的愈伤中，在不使用任何筛选标记的情况下快速获得相应基因的突变株系[52]。Zhang等通过CRISPR/Cas9 RNPs将gw2-RNPs转化到小麦原生质体中，gw2-RNPs诱导的Ta GW2基因在小麦A、B、D染色体组的突变频率分别为94.3%、33.4%、21.8%[53]。Shan等利用CRISPR/Cas9，对水稻和小麦进行序列特异性基因编辑并且小麦双等位基因pds突变体具有预期的表型[54]。

4 展望

CRISPR/Cas9系统是生命科学的重大发现之一，具有广泛的发展和应用前景。可以定点敲除不利基因，对作物进行定向改良，也可进行基因替换、插入，使一些优良基因在其他作物中稳定遗传。既能够解决传统育种技术与分子标记辅助育种的弊端，拓宽选育品种的遗传背景，见效快;又能避免转基因育种技术带来的安全问题，精准地达到育种目标，品种的安全性更高。毫无疑问，CRISPR/Cas9系统将成为作物育种和改良的重要技术。但CRISPR/Cas9 系統也存在一些问题。CRISPR/Cas9技术目前在水稻遗传改良中相对比较成熟，在其他作物的基因编辑改良中需要进一步改善优化，使得CRISPR/Cas9技术可以在多种作物中广泛应用，提高突变率;脱靶效应高和同源重组（HR）编辑效率低是CRISPR/Cas9技术难以攻克的难题，需要进一步加强完善，降低脱靶效应;解决能够同时对多个不同基因进行定点精准编辑的问题。目前，CRISPR/Cas9系统在作物遗传改良的应用还处于初级阶段，也在不断完善发展，相信在将来能克服种种困难，对作物进行定向改良，获得更优质、更理想的品种，将成为作物育种的重要生物技术。

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