常宇桐,罗云敬,*,钱承敬,杨永坛,*,史晓梅

(1.北京工业大学 生命科学与生物工程学院,北京 100124;2.中粮营养健康研究院 营养健康与食品安全北京市重点实验室/老年营养食品研究北京市工程实验室，北京 102209)

白酒，又称烧酒，是中国传统的蒸馏酒[1]。中国的蒸馏白酒历史长久，传统工艺精湛，风格特征典型，产品质量优异，深受国内外消费者喜爱，中国的白酒与白兰地、威士忌、伏特加、朗姆酒和金酒并称为世界著名的六大蒸馏酒[2]。乙醇和水是白酒的主要成分，而白酒中的微量成分，却是决定白酒风味的关键。馥郁香型是“酒鬼酒的独创”，两香为兼，三香为馥，在保持原有风格的基础上，融“泸型之浓香、汾型之清香、茅型之酱香”于一体，一口之间，可品出前浓、中清、后酱[3]。

液液萃取技术(liquid-liquid extraction technique，LLE)开始于19世纪60年代，此技术是依据相似相溶的原理实现的[4-5]。范文来等[6]应用液液萃取结合正相色谱技术，采用气相色谱结合质谱，从清香型汾酒与酱香型郎酒中检测到1500个峰，鉴定出698种挥发性成分，其中含有酯类物质167种，醇类物质67种，醛类物质33种，酮类物质48种，缩醛类物质18种，有机酸34种等。全二维气相色谱(comprehensive two dimensional gas chromatography，GC×GC)是把分离机理不相同但又相互独立的两根色谱柱通过串联的方式进行结合而成的气相色谱[7-10]。周庆伍等[11]应用全二维气相色谱- 飞行时间质谱联用仪(GC×GC- TOF/MS)结合顶空固相微萃取技术(HS- SPME)首次全面剖析了古井贡酒中的挥发性风味成分，共鉴定出包含醇类、酸类、酯类、醛酮类物质以及包括健康功能成分在内的挥发性风味成分800多种。

本研究采用液液萃取技术，结合全二维气相色谱- 四极杆质谱，对白酒中挥发性成分进行定性和定量分析，并与一维色谱分析结果进行对比，以期为白酒在生产与勾兑过程中控制其风味提供理论与实践指导。另外，结合主成分分析的分析方法，对不同等级的馥郁香型白酒进行分类，以期为白酒勾兑后等级评定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

GC/MS- QP2010 Ultra型全二维气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；一维数据采集由GC- MS solution 2.5软件完成，二维数据分析由GC Image R 2.7软件完成。

乙醚、氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙醇、正己烷，色谱纯，美国Fisher公司；76种风味物质标准品，北京振翔科技有限公司。混合标准溶液的配置：分别取100 μL质量浓度为10 000 mg/L的单体标准品用乙醇定容至10 mL，作为标准储备液，密封后置于4 ℃保存。

市场上某品牌10年陈酿68°馥郁香型基酒，某酒厂提供；市场上某品牌的三类馥郁香型白酒各4瓶，北京某大型超市。

1.2 气相色谱和质谱条件

一维色谱柱：Rtx- WAX型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，日本岛津公司；二维色谱柱：BPX- 5型(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm),日本岛津公司。进样口温度250 ℃；恒线速度操作模式；进样量为1 μL，分流比10∶1；程序升温：初始温度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

四极杆质谱：电子轰击离子源(electron ionization,EI);采集方式全扫描Scan；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；采样频率33 Hz；质量扫描范围35～320 u，溶剂延迟时间3.5 min；调制周期4.2 s，热喷时间350 ms。

1.3 样品前处理

液液萃取：取10 mL酒样于50 mL离心管中，将酒样用去离子水稀释至乙醇体积分数为30%，NaCl搅拌至溶液饱和。然后依次用5 mLV(乙醚)∶V(正己烷)=2∶1溶剂萃取2次，每次10 min，3 000r/min，离心5 min后取上层溶液，合并醚烷萃取液，氮吹浓缩至1 mL，制得样品溶液，供全二维气相色谱- 质谱分析。

1.4 实验数据处理

实验数据分析与处理采用美国Zoex公司开发的GC Image R2.5全二维数据处理系统进行，识别信噪比大于120的色谱峰后进行自动积分和质谱库比对，质谱库为NIST MS Search 2.0，所有比对结果导出生成“峰表”[12]。“峰表”经过进一步与标准品对比验证及人工解谱后作为初步鉴定结果。最后去除烷烃类等对风味没有贡献的化合物，选择正相相似度大于800，反相相似度大于800的化合物作为最终定性结果。风味物质定量计算方法为：面积归一化法，即该物质峰面积与总峰面积的比值，同时与GC- FID测绝对含量的数据进行比较，以确定数据的准确性。文中阈值根据文献[13]的研究方法，由5名酒厂的专业品评师组成并测定。主成分分析采用SPSS 24.0软件进行。

2 结果与讨论

2.1 GC×GC- MS条件优化

2.1.1色谱柱的选择

为了获得最大的峰容量和分离度，对GC×GC- MS中的色谱柱系统进行了优化，主要选择了2种柱系统进行优化，方案1中一维为极性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)Rtx- WAX色谱柱，二维为非极性柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm)BPX- 5色谱柱；方案2中一维为非极性(30 m×0.25 mm×0.25 μm)Rtx- 1色谱柱，二维为中等极性柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm)BPX- 50色谱柱。白酒中的风味物质多为醇、醛、酸、酯、酮类。其中，醇、酮、酸、醛类物质为极性物质，酯类为弱极性物质，全二维分离效果取决于第一根色谱柱，故一维选择极性柱，按极性将其分开，非极性柱无法实现此目的。二维选择非极性柱，其目的是将一维无法分开的物质在二维上按沸点的不同将其再次分离，达到较好的分离效果。其分离效果见图1，方案1的分离效果明显好于方案2，所以，本研究最终确定的柱系统是方案1。

图1 不同柱系统下白酒中挥发性风味物质的分离情况Fig.1 Separation of volatile aroma components in Baijiu by different column systems

2.1.2调制器参数优化

调制器是全二维色谱的核心部分，主要起到捕集、聚焦、再传送的作用，调制器包括冷喷和热喷两个关键部分。从第一支色谱柱流出的分析物，首先在冷喷气的作用下低温凝结之后再在热喷气的作用下高温脱附从而释放到第二支色谱柱中。在全二维气相色谱运行的过程中，冷喷气会持续释放，热喷气脉冲式喷射，前后两次热喷的时间间隔称为调制周期(modulation period)，每次热气释放的时间称为热喷时间[14]。

调制周期是调制器的重要参数，它会在很大程度上影响着物质的鉴定和识别。为了保证一维色谱柱的分辨率，调制周期不应该过长，理论上调制周期应低于一维色谱峰宽的1/3。但是，过短的调制周期，会出现在一个周期内的待测物未完全洗脱下来，下一个调制周期的样品就已经进入到二维色谱柱的现象，即“圈绕(wraparound)现象”[15]。在此基础上，选择几个保留时间较长的化合物作为参考，根据调制周期的设定规则，最终选择3.0、4.2、6.0 s对白酒样品进行分析，图2分别给出了不同调制周期下的全二维气相色谱—四极杆质谱分离图。由图2可知，调制周期为3.0 s时产生非常明显的圈绕现象，不利于谱图的分析；调制周期4.2 s和6.0 s时没有此现象，各组分在一个周期内调制完成，且峰型良好，分离度高，灵敏度好。在满足分离度的条件下，尽可能选择短的调制周期，可以减少峰展宽，保证第一根柱的正交分离，同时，减少一维色谱的柱效损失，保证保留时间的精确度，有利于定性分析[15]，因此选择4.2 s作为较佳的调制周期。

图2 不同调制周期下白酒中挥发性风味物质在的二维色谱Fig.2 Slice profile of volatile aroma components in Baijiu by GC×GC under different modulation periods

2.1.3质谱扫描质量范围的确定

对白酒中存在的挥发性香气成分进行检测和识别，需要采用全扫模式进行分析，为增加定性定量的准确度和灵敏性，需要使用尽可能高的扫描频率。由于此次实验使用的全二维气相色谱是采用半导体制冷的方式，与液氮制冷的最大区别是冷冻温度不同，半导体制冷的冷冻温度是-90 ℃，而液氮制冷能达到的冷冻温度是-196 ℃，其弊端是可能会导致C7以下的化合物冻不住，而不能达到很好的分离效果。考虑到白酒中的挥发性风味成分较多且较为复杂，为保证色谱图的完整性，起始扫描荷质比设定为35，对于扫描荷质比的上限，根据一维色谱的检测经验，最终选择320为扫描的最大荷质比。在35～320 u的扫描范围内，当设定四极杆的扫描速率为20 000 u/s时，扫描的频率可达33.3 Hz，保证了化合物的准确定性和定量。

2.2 馥郁香型白酒风味成分总体轮廓定性定量分析

通过全二维气相色谱- 四极杆质谱法得到的结果对馥郁香型白酒进行定性分析，得到它的全二维轮廓图(图3)。通过对其化学成分分析，结合其总离子流图(total ion current，TIC)、标准品、NIST谱图库及人工解谱，以各种成分的相似度为参考，在馥郁香型白酒中共鉴定出308种匹配度较高的挥发性风味成分，其中酯类物质102种，醇类物质42种，酸类物质33种，醛类物质26种，酮类物质19种，其他物质86种，各类化合物的主要组成成分见表1。

图3 馥郁香型白酒风味成分全二维轮廓图Fig.3 Two-dimensional contour map of volatile aroma components in Fuyu flavor Baijiu

表1 GC×GC- MS鉴定出馥郁香型白酒基酒中的主要化合物Tab.1 Main compounds in Fuyu flavor Baijiu identified by GC×GC- MS

用同样的前处理方式和仪器条件，运用GC- MS对馥郁香型白酒的挥发性风味成分进行定性分析，共鉴定出65种挥发性香气成分，远远少于GC×GC- MS技术所鉴定出来的308种香气成分，这说明GC×GC- MS具有峰容量大、灵敏度高、分辨率高等优点，能够将在一维色谱不能分开的物质在二维上得到较好的分离效果，适合分析中国传统白酒这种十分复杂的体系。

2.3 感官评级与色谱结果对比

目前对白酒样品等级评定主要依靠感官品评来进行，然而，培养一个专业的品评师，需要花费大概2～3年的时间，且在品评过程中对环境的要求较为严苛，主观性较大，会出现判断不准确的现象，故在实际应用过程中，需要多名品评师共同进行感官品评以保证结果的准确性。因此，迫切需要寻求一种有效的化学检测技术结合数据分析软件对白酒进行等级评定。

运用已优化的色谱- 质谱条件对感官品评结果分为甲、乙、丙3个等级，每个等级的4个样品，共12个市售馥郁香型白酒样品进行测定(见表2)，之后利用SPSS 24.0软件进行主成分分析，通过主成分分析可以设法将原来变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量，同时根据实际需要从中可以取出几个较少的综合变量尽可能多地反映原来变量的信息[16]。对所测结果进行分析，选择12个样品的62个共有峰。由于本实验为市售的成品酒，是基酒进行勾兑和稀释后得到的，故所测出来的挥发性香气成分没有基酒中多，又由于不同等级的成品酒中的挥发性香气成分及其含量有所区别，所以此处定性定量检测到62个共有峰。

表2 馥郁香型白酒样品组成Tab.2 Compositions in Fuyu flavor Barjiu

将62个共有峰经过有限次剔除后共保留了14个共有峰(见表3)，再用上述14个共有峰进行主成分分析，主成分分析结果见表4，从表4可以看出，前4个主成分的累积贡献率92.27%，基本反映了原指标的信息。表4中4个彼此不相关的综合指标涵盖了删减后14个共有峰的信息，并且它们所代表的信息不重叠。

将选出的14个共有峰数据进行主成分分析后，以其第二主成分的得分对第一主成分的得分做散点图即可得到所有样本的PCA投影图。图4为3等级12个样品在这6个主要特征值上的得分投影图。由图4可见，运用上述方法结合主成分分析，能够将馥郁香型白酒进行分类，且所得结果与感官品评结果完全一致，表明该方法对不同等级馥郁香型白酒的判别是可行的。

表3 馥郁香型白酒挥发性香气成分中的共有化合物Tab.3 Common volatile compounds in Fuyu flavor Baijiu

表4 6个主成分的特征值、贡献率和累积贡献率Tab.4 Eigenvalue,contribution rate and cumulative contribution rate of 6 principal components

图4 主成分分析后的PCA投影图Fig.4 Projection plot of principal component analysis

3 结 论

采用液液萃取结合全二维气相色谱- 四极杆质谱技术建立了馥郁香型白酒中挥发性香气成分的分析方法并解析了白酒中挥发性组分。研究发现应用极性不同的全二维色谱柱系统结合四极杆质谱能够有效实现白酒中复杂挥发性组分的分离与分析。与传统的一维色谱相比，许多在一维色谱中没有分离的化合物在二维色谱中均得到了较好的分离效果。运用该方法在馥郁香型白酒中共检测到308种挥发性香气成分，远多于一维色谱的65种，其中，酯类物质102种，醇类物质42种，酸类物质33种，醛类物质26种，酮类物质19种，其他物质86种，体现了馥郁香型白酒挥发性香气成分的复杂性，同时也充分证实了全二维气相色谱具有较大的峰容量，较高的灵敏度和较高的分辨率的特点，为白酒中挥发性风味成分的分析提供了更为高级的分析手段。GC×GC- MS由于其优越性能，能够成为白酒挥发性风味成分检测的重要分析方法，可以对白酒等传统风味食品的挥发性风味化合物进行准确的定性和定量，更全面、准确地了解食品的特征挥发性风味物质，为研究食品风味的特征形成机制以及品质控制方面提供更加准确的理论依据。运用主成分分析能够观测到不同等级馥郁香型白酒的分类趋势，且结果与感官品评结果一致，能够为工厂在白酒生产过程中等级评定环节提供理论指导。