关 琳，王丹丹，祝昊丹，周俊明，孙 珂，吕立新，俞正玉，何孔旺，李 彬，倪艳秀

猪链球菌(Streptococcussuis)是一种重要的人兽共患病原菌，根据荚膜多糖抗原的不同，将猪链球菌分为33个不同的血清型，包括1-31型、33型及1/2型[1]，其中1型、2型、7型和9型在临床上较为常见。近年来，猪链球菌9型(Streptococcussuisserotype 9，SS9)在我国流行越来越广泛[2-3]，并且泰国曾报道已有人感染猪链球菌9型菌株[4]。抗生素作为治疗猪链球菌的首选方法，被应用于猪的饲养生产中，但抗生素的广泛应用以及不合理的使用，使得猪链球菌对各类抗生素的耐药性逐渐增强，甚至出现多重耐药，给临床治疗带来了困难[5-7]。而且耐药性可通过食物链传递给人类，使耐药性在人畜之间进行传递，对人类健康也产生巨大的威胁，耐药性问题已成为全球关注的热点。

国内外研究表明从不同国家不同地区分离出的猪链球菌对抗生素耐药性存在不同，但大多数对四环素类、大环内酯类、磺胺类以及林可胺类都具有较强的耐药性[8]。由于细菌受到抗生素强大的选择，从而使动物体内的病原菌与正常猪链球菌相互作用，逐渐产生了不同的耐药机制。研究表明，同一种抗生素可能存在多种耐药机制，一种耐药机制也可能在不同种抗生素中发挥作用[9]。对于猪链球菌的耐药机制产生的因素较多，主要包括遗传因素、化学因素及环境因素的影响。因此了解猪链球菌的耐药性及耐药机制，从根源减少耐药菌株的产生具有重要意义。

目前，对于猪链球菌的耐药性研究的菌株多为猪链球菌2型，未见专门对猪链球菌9型耐药性的分析。本试验通过纸片扩散法和PCR技术检测了猪链球菌9型的耐药性及相关耐药基因，以期为猪链球菌9型的预防和临床治疗提供参考，减少耐药菌株的出现。

1 材料与方法

1.1菌株来源 22083为猪链球菌9型参考菌株，GZ0565与SH040917由南京农业大学惠赠，其余菌株由本实验室分离鉴定并保存，菌株信息见表1。药敏质控菌为金黄色葡萄球菌ATCC29213，由本实验室保存。

1.2主要仪器与试剂 超净工作台购自苏净集团安泰公司；DNP-9272 型电热恒温培养箱购自上海精宏试验设备有限公司；摇床购自太仓市强乐实验设备有限公司；PCR仪购自Takara公司；Todd-Hewitt Broth(THB)购自美国BD公司；Mueller-Hinton Broth(MHB)培养基购自北京陆桥技术有限公司；无菌脱纤维马血购自美国Thermo公司，琼脂粉购自索莱宝科技有限公司；基因组提取试剂盒为OMGA公司产品；2× Premix Taq和DL2,000 DNA Marker购自Takara公司，药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

THB液体培养基参照产品说明书配置，THB平板于液体培养基中添加1.5%琼脂粉经高压灭菌；MH血平板于MHB液体培养基中添加1.5%琼脂粉经高压灭菌后，取出，室温冷却至50 ℃左右，加入5%的无菌脱纤维马血。

1.3菌株培养 将SS9菌株冻存液连续在THB中传2代复壮后，采用三区划线接种于THB平板上，37 ℃过夜培养，分别用无菌接种环挑取形态学上相似的菌落到无菌的生理盐水中以获得悬浮液，将菌液调至0.5个麦氏浊度，浓度约1×108CFU/mL～2×108CFU/mL，15 min内使用。

表1 菌株来源

Tab.1 Source of strains

菌株名称来源地区分离时间组织22083病猪丹麦不详肺GZ0565病猪广东广州2005 脑SDQD080923病猪山东青岛2008.09.23肺GDZQ140619病猪广东肇庆2014.06.19心GDZQ140705病猪广东肇庆2014.07.05心GDKP140715病猪广东开平2014.07.15肺GDZQ140716病猪广东肇庆2014.07.16心GDKP140725病猪广东开平2014.07.25肺JSSQ151224病猪江苏宿迁2015.12.24肺JSSY160913病猪江苏泗阳2016.09.13肺JSJJ170109病猪江苏靖江2017.01.09肺SH040917健康猪上海2004扁桃体JSJY1608健康猪江苏江阴2016.08鼻拭子JSNT1608健康猪江苏南通2016.08鼻拭子JSCZ170720健康猪江苏常州2017.07.20鼻拭子

1.4耐药性检测 采用纸片扩散法检测15株SS9菌株对9类21种不同抗生素的耐药性，根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)规定的方法进行操作，具体步骤为：以无菌棉拭子蘸取菌株稀释液，在管壁的内侧挤去棉棒上多余的水分，从3个方向上均匀涂布整个MH血平板表面。然后用无菌的镊子夹取药敏纸片，将其贴在平板表面。将平板置于37 ℃培养18～24 h后，测定抑菌圈直径大小。根据产品说明书判定菌株的耐药性。

1.5耐药基因检测 根据NCBI上的基因序列设计引物，通过PCR方法对猪链球菌血清9型菌株的四环素耐药基因(tetM，tetO)和大环内酯类耐药基因(mefA，ermB，mrsD)进行分析。引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反应体系为：2× Premix Taq 12.5 μL，10 pmoL/mL上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，无菌ddH2O补足至25 μL。反应体系：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72℃延伸1 min 45 s，30个循环后再72 ℃延伸5 min。引物序列、退火温度及片段大小见表2。

表2 扩增猪链球菌9型耐药基因引物序列

Tab.2 Primers sequences of drug resistance gene for PCR

抗生素种类耐药基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp四环素类tetMAGTTTTAGCTCATGTTGA1 800TCCGACTATTTGGACGACGGtetOAACTTAGGCATTCTGGCTCAC515TCCCACTGTTCCATATCGTCA大环内酯类mefAAGTATCATTAATCACTAGTGC348TTCTTCTGGTACTAAAAGTGGermBGAAAAGGATCTCAACCAAATA639AGTAACGGTACTTAAATTGTTTACmrsDCCTTATCGGCACAGGTTCAT500GCCTTCCGGAGCTCCTACTT

2 结 果

2.1耐药性检测结果 15株猪链球菌9型的耐药性如表3所示，菌株对大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素)、林可胺类(克林霉素、林可霉素)均100%耐药，对四环素、链霉素耐药性较高，耐药率都为93.3%，对β-内酰胺类中的阿莫西林和头孢类抗生素、氯霉素类、糖肽类以及庆大霉素较为敏感。

表3 15株猪链球菌9型的耐药性分析

Tab.3 Results of drug resistance of 15 SS9 strains

抗生素种类抗生素名称英文缩写敏感(株)中介(株)耐药(株)耐药率(%)β-内酰胺类青霉素GP26746.67阿莫西林AMX14100.00头孢吡肟CPE120320.00头孢唑啉CZ121213.33头孢克洛CF120320.00糖肽类万古霉素VA130213.33氨基糖苷类丁胺卡那AK52853.33卡那霉素KAN09640.00庆大霉素GM130213.33链霉素S011493.33大环内酯类红霉素E0015100.00阿奇霉素AZM0015100.00乙酰螺旋霉素ASP0015100.00四环素类四环素TE011493.33多西环素DOX131173.33表3(续)抗生素种类抗生素名称英文缩写敏感(株)中介(株)耐药(株)耐药率(%)喹诺酮类环丙沙星CIP29426.67香豆素类新生霉素NV6900.00氯霉素类氯霉素CHL112213.33氟苯尼考FFC11316.67林可胺类林可霉素MY0015100.00克林霉素CLI0015100.00

2.2多重耐药性分析 15株猪链球菌9型均多重耐药，且均在7重及7重耐药以上，最高可耐16重药物；8重耐药的菌株数最多，共有6株；耐7、9、10、11、13重抗生素的菌株各有1株；耐12、16重抗生素的菌株各有2株。结果如表4所示。

表4 15株猪链球菌9型的多重耐药性结果

Tab.4 Results of multidrug resistance of 15 SS9 strains

菌株耐药谱耐药重数22083AK+KAN+S+E+AZM+ ASP+MY+CLI8GZ0565P+CPE+CF+VA+AK+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI12SDQD080923P+S+E+AZM+ ASP+TE+DOX+MY+CLI9GDZQ140619S+E+AZM+ ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDZQ140705S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDKP140715S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDZQ140716S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDKP140725S+E+AZM+ASP+TE+MY+CLI7JSSQ151224AK+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+CIP+MY+CLI10JSSY160913P+CPE+CF+AK+KAN+GM+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+CIP+CHL+MY+CLI16JSJJ170109P+AK+S+E+AZM+ASP+TE+CIP+CHL+MY+CLI11SH040917P+CZ+AK+KAN+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI12JSJY1608KAN+S+E+AZM+ASP+TE+MY+CLI8JSNT1608P+CPE+CZ+CF+AK+KAN+GM+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+CIP+MY+CLI16JSCZ170720P+VA+AK+KAN+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+FFC+MY+CLI13

2.3耐药基因检测结果 对四环素耐药基因(tetM，tetO)、大环内酯类耐药基因(mefA，ermB，mrsD)的PCR检测结果见表5，由此可知，15株菌中，除了22083外，其他菌株均检测到tetO基因，而仅有1株菌(JSNT1608)存在tetM基因。所有分离株均扩增到ermB基因，而mefA基因仅在1株菌(JSJJ170109)中检测到，mrsD基因仅在3株细菌中检测到。tetO、ermB基因扩增结果分别见图1、图2。

表5 大环内酯类和四环素类耐药基因携带情况

Tab.5 Detecting results of macrolide and tetracycline resistance genes by PCR

抗生素种类耐药基因PCR阳性菌株数阳性率(%)四环素类tetM16.67tetO1493.33大环内酯类mrsD320.00mefA16.67ermB15100.00

M:DL2000 DNA Marker；1-15:检测样品；16:阳性对照；17:阴性对照图1 tetO耐药基因检测结果Fig.1 Detecting results of tetO resistance gene

M:DL2000 DNA Marker；1-15:检测样品；16:阳性对照；17:阴性对照图2 ermB耐药基因检测结果Fig.2 Detecting results of ermB resistance gene

3 讨 论

本研究发现该15株SS9对大环内酯类及林可胺类耐药率均为100%，对四环素类耐药率高达93.3%，对头孢类、氯霉素类、阿莫西林、糖肽类以及庆大霉素较为敏感。所有菌株均达到7重耐药，8重耐药菌株共有6株，16重耐药菌株有2株，说明SS9的耐药情况十分严重；分离自广东地区患病猪的菌株以8重耐药为主，而分离自江苏的菌株最少为8重耐药，甚至达到16重耐药，说明不同地区9型猪链球菌耐药性存在较大差异；分离自健康猪的菌株其多重耐药率要高于分离自患病猪菌株的耐药率。结果表明，SS9的耐药情况十分严重，这可能是由于我国广泛使用抗生素，甚至滥用，使细菌长期接触，因此产生耐药性。因此临床用药时应尽量避免使用大环内酯、林可酰胺类及四环素类等抗生素，合理选择对细菌较为敏感的药物，以免SS9在我国呈暴发性流行。

大环内酯类抗生素的抗菌机制是其进入细胞后结合于核糖体50S大亚基，抑制肽酰基转移酶，从而阻碍细菌蛋白质的合成。猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要是主动外排机制和靶位修饰[10]。主动外排机制主要是由于细菌体内外渗透压不同，细菌在能量存在下经细胞膜将菌体内高浓度的药物排出体外，从而使自身适应外界环境。对革兰氏阳性菌而言，这一过程主要由转运子超家族的mrs及易化子超家族成员mef基因编码产生[11-12]。mefA为近年来常见的猪链球菌耐药基因，其位于染色体 DNA 上，大小为 1 218 bp，下游为msrD基因，大小为 1 464 bp[13]。试验结果显示15株耐药菌株中仅有1株细菌JSJJ170109具有mefA基因，有3株菌株具有msrD基因，表明猪链球菌9型菌株对大环内酯类耐药机制并非为主动外排。靶位修饰是一种甲基化过程，主要是由于细菌靶位23S rRNA的特定氨基酸被erm酶甲基化后，核糖体构象改变，阻断了大环内酯类药物与靶位结合，从而导致猪链球菌耐药性产生。最早发现的猪链球菌甲基化酶为ermB基因，后又发现了其同源性ermA基因。试验结果显示15株耐药菌株的ermB基因检出率为100%，表明该15株菌株对大环内酯类抗生素耐药的机制主要是ermB基因甲基化的结果。

细菌对四环素的耐药机制主要有主动核糖体保护蛋白机制、外排蛋白机制、钝化或灭活四环素酶机制[14]以及16S rRNA基因位点突变影响等[15]，由不同的tet耐药基因决定，其中国内外研究表明猪链球菌对四环素的耐药机制主要为核糖体保护蛋白机制[16]。目前对tetM和tetO基因的研究最多，且猪链球菌对四环素的耐药基因主要为此两种基因[17-18]。谈忠鸣等[19]在2015年对1998-2010年分离自江苏的27株猪链球菌2型(SS2)进行耐药性分析中发现，所有菌株对四环素都耐药，只有1株菌存在tetO基因，其余均存在tetM基因。而本试验研究结果发现15株SS9中有14株存在tetO基因，仅有1株存在tetM基因。这表明尽管2种血清型的猪链球菌对四环素的耐药性都很高，但引起耐药的基因是不同的，SS2对四环素产生极高耐药率的基因主要是tetM基因，而SS9主要是tetO基因。

本研究为猪链球菌9型的预防和临床治疗、耐药性及耐药机制的研究提供了参考依据。

利益冲突：无