盛安群 陈翠娥 孙媛媛 张希希 钱燕 朱融和 周爱华 王楸 冯建华

支气管肺发育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD）是胎龄＜32周早产儿最常见的并发症，由高氧、感染、炎症、机械通气等多因素引起，易继发肺炎、肺动脉高压等并发症，严重影响患儿生长发育及生存质量[1-4]。近年来随着早产儿救治成功率的不断升高，BPD发病率逐年升高[5]。但治疗BPD的措施仍十分有限，且疗效欠佳。中性粒细胞诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒细胞释放到胞外的包含有游离DNA、组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G的网状结构，是区别于凋亡与坏死的另一种细胞死亡方式[6]。NETs是机体重要的免疫防御机制，但其过度释放或清除不及时，NETs相关效应分子则会导致组织损伤、器官功能失调或衰竭。相关研究发现，在多种炎性肺疾病（如囊性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征、肺气肿、输血相关性急性肺损伤等）中，均伴有NETs高表达及清除减少[7-11]。本研究建立高氧致BPD新生鼠模型并检测其血清及肺组织中NETs变化，以进一步探讨NETs在BPD发病机制中的作用，同时采用肝素干预并分析其对NETs的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 取SD成年大鼠[体重180～200g，购自上海实验动物中心 SCXK（沪）2012-0002]，以雌雄比 3∶1合笼交配，每日清晨对雌鼠行阴道分泌物涂片、镜检，发现精子细胞后分笼饲养直到自然生产；取自然生产的48只新生SD大鼠为实验对象，体重6～7g。本实验得到温州医科大学实验动物中心的许可。

1.2 主要仪器和试剂 氧舱自动控制系统（温州医科大学机能实验中心自制），测氧装置（TRD-2E1500B，德国 Envite C-Wismar公司），控氧仪（24h HBO-2B，浙江建德梅城电化分析仪器厂），二氧化碳检测仪（S80053，德国Envite C-Wismar公司），共聚焦显微镜（FV1000，日本OLYMPUS公司），荧光酶标仪（POLARstar OPTIMA，德国BMG公司）。定量PicoGreen dsDNA试剂盒（P7589，加拿大Invitrogen公司），抗组蛋白H3抗体（SC51716，美国Santa Cruz公司），抗髓过氧化物酶抗体（GB11224，武汉谷歌生物科技有限公司），肝素钠注射液（G2016，江苏千红生化制药股份有限公司）。

1.3 动物分组与处理 将新生鼠随机分为空气组、高氧组、肝素组（O2+肝素）、对照组（O2+0.9%氯化钠溶液），每组12只。空气组置于空气中，其他3组置于氧浓度为90%的高氧箱7d建立BPD模型。肝素组于造模开始后，每天腹腔注射低剂量肝素（250U/kg）至造模结束；对照组每天腹腔注射约25μl 0.9%氯化钠注射液。室温控制在（25±2）℃，湿度维持在 50%，给予动物 12h光/暗交替的环境，保证饲料和水充足，每日开箱1h。分别在出生后第7、14天每组各取6只，水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速切开左颈部皮肤，分离出颈总动脉，采集血液标本，并置于含3.8%枸橼酸三钠的EP管中，离心后吸出血清，置于-80℃冰箱保存，用于血清游离DNA水平检测。切开新生鼠胸前皮肤，钝性分离皮下组织、肌肉，切断肋骨，打开胸腔，暴露肺组织，结扎右侧支气管，4%多聚甲醛溶液灌注左肺并固定，置于4℃冰箱保存，用作肺组织形态学分析及共聚焦纤维成像。

1.4 血清中游离DNA水平检测 采用荧光染色法。使用PicoGreen双链DNA荧光定量测定试剂盒检测血清中游离DNA水平。稀释标准品储液和样品，每孔50μl加入到96孔板，加入PicoGreen荧光染料100μl，室温避光2～5min，荧光酶标仪检测荧光强度，根据标准曲线计算cf-DNA/NETs，即游离DNA水平。

1.5 NETs免疫荧光染色及观察 取左肺组织，石蜡包埋，4μm切片，脱蜡，柠檬酸盐缓冲液提取抗原，0.1%Triton X-100渗透10min，封闭标本，抗瓜氨酸组蛋白H3（1∶100）、抗髓过氧化物酶抗体（1∶500）4℃孵育过夜，PBS清洗，二抗（1∶400）37 ℃孵育 1h。采用 4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色 5～10min、90%甘油封片，共聚焦显微镜成像并观察切片荧光信号范围。

1.6 肺组织形态学观察 取左肺中叶，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，4～5μm切片，HE染色，观察肺组织形态变化。在光镜下摄片，计数肺泡辐射状计数（RAC）[12]和平均内衬间隔（MLI）[13]。

1.7 统计学处理 应用SPSS 25.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组新生鼠血清中游离DNA水平比较 出生后第7、14天，高氧组、对照组新生鼠血清游离DNA水平明显高于空气组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；肝素组新生鼠血清游离DNA水平明显低于高氧组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 4组新生鼠血清中游离DNA水平比较（ng/ml）

2.2 4组新生鼠肺组织荧光显微镜下NETs变化 出生后第7、14天新生鼠肺组织NETs免疫荧光染色观察，与空气组比较，高氧组和对照组肺组织组蛋白、髓过氧化物酶荧光信号范围明显增加，提示NETs数量增加，见图1；这证实高氧暴露会增加肺组织损伤。肝素组与高氧组相比较，荧光信号范围减少；与空气组比较差异不明显，提示肝素干预可以减轻肺组织NETs形成。

图1 4组新生鼠肺组织荧光显微镜下NETs变化

2.3 4组新生鼠肺组织形态学比较 随着鼠龄增加，空气组新生鼠肺组织发育逐渐成熟，肺泡明显增多；高氧组、对照组在第7天即可观察到肺泡简单化，即肺泡壁变薄，部分肺泡融合，第14天时肺发育依然受阻明显，肺泡腔扩大，数目减少，结构紊乱，提示肺组织发生了类似BPD的病理改变；肝素组肺泡发育受阻不明显，见图2。出生后第7、14天，与空气组比较，高氧组、对照组新生鼠RAC明显减少，MLI明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与高氧组比较，肝素组RAC明显增加，MLI明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；肝素组与空气组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 4组新生鼠肺组织RAC及MLI比较

图2 4组新生鼠肺组织形态学观察（HE染色，×100）

3 讨论

BPD是极低出生体重儿常见的呼吸系统并发症，严重影响患儿的生存质量[5]。BPD病因复杂，其中早产儿肺发育不完善是BPD的发病基础，其他因素如高氧、机械通气、感染、炎症等均可加重BPD。中性粒细胞是人体固有免疫应答的重要细胞，在BPD发病机制中发挥着重要作用，中性粒细胞的聚集和激活是引起肺部毛细血管和肺泡损伤的主要原因。研究发现，高氧暴露后新生鼠肺组织中性粒细胞明显增多，肺组织明显受损；而通过减少或清除肺内中性粒细胞后，肺组织受损情况可出现明显好转[14]。

NETs是由德国科学家Brinkmann等[15]发现的，它是活化的中性粒细胞释放到胞外的，包含DNA、组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G等构成的网状结构。它的形成是区别于凋亡和坏死的另一种细胞死亡方式，NETs介导的杀灭途径是人体重要的天然免疫应答机制，组织中NETs的诱捕作用能使机体有效防御病原体感染，减少病原体向血液扩散。然而，如果机体局部出现高浓度NETs，即可诱导大量胞外组蛋白释放，同时诱导内皮细胞损伤、凝血功能障碍和炎症反应，最终导致组织损伤、器官功能失调或衰竭。既往研究发现，多种炎症性肺疾病，包括囊性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征等均伴有中性粒细胞及NETs高表达，且清除减少[10-11，16-19]。Saffarzadeh 等[20]研究发现，NETs可直接导致肺上皮细胞和内皮细胞死亡，其细胞毒性呈剂量依赖性；同时抗组蛋白抗体及髓过氧化物酶抑制剂可明显改善NETs引起的细胞毒性。本研究检测了高氧致新生鼠BPD模型血清及肺组织中NETs水平，结果显示血清中游离DNA水平及肺组织NETs数量均明显升高；这提示NETs过度表达介导了BPD发病，为BPD发病机制提供了新的理论依据。

肝素是一种酸性黏多糖，带负电荷；组蛋白是真核生物细胞染色质中的碱性蛋白质，带正电荷。肝素可直接结合组蛋白，并能有效减轻组蛋白介导的细胞毒性反应[21-22]。近期多项研究结果提示，肝素可与细胞外组蛋白结合，降低NETs的活性，从而削弱NETs介导的凝血作用和感染相关的血管功能障碍，减轻NETs的生物毒性反应[21]。非抗凝血肝素也可以与组蛋白结合，抑制组蛋白介导的细胞毒性，并可降低无菌性炎症和脓毒症小鼠模型的死亡率[23]。低分子肝素亦可阻止活化的中性粒细胞自噬诱导和NETs的形成[24]，对脓毒血症所致的急性肺损伤具有良好的治疗作用。本研究结果显示，高氧暴露可导致新生鼠肺泡发育停滞，表现为RAC下降、MLI升高；而肝素干预后，肺泡发育停滞改善，RAC升高，MLI下降，同时NETs水平明显下降。

综上所述，NETs在BPD发病中发挥了重要作用，而肝素可通过中和胞外组蛋白、破坏NETs结构来达到改善BPD的作用。本课题从全新的角度阐明了肝素在BPD治疗中的作用，为其临床应用转化提供了一定的理论依据。