许东亮， 彭朝晖， 刘涛△

1河南省人民医院、郑州大学人民医院、河南大学人民医院口腔医学中心(河南郑州 450003); 2中国平煤神马医疗集团总医院口腔科(河南平顶山 467000)

种植体周围炎是由于口腔细菌微生物引发的种植体周围硬软组织的炎症，临床表现为探针出血、黏膜红肿、溢脓等，若治疗不及时，最终可能导致种植体松动脱落[1]。目前治疗种植体周围炎的方法是牙周基础治疗结合抗生素的使用，然而，种植体周围炎疾病进展迅速，致炎因子引起的破骨细胞活化易导致牙槽骨吸收平衡遭到破坏，传统治疗方式对改善或逆转牙槽骨吸收效果不明显[2]。因此，在种植体周围炎症初期抑制破骨细胞活化，维持牙槽骨吸收与新生的平衡，对临床治疗种植体周围炎具有十分重要的意义。然而种植体周围炎与种植体龈沟液中生物学指标的关系仍有待进一步探究，研究表明，miR-23a在慢性炎症反应中表达上调，与肝炎、牙周炎等炎性疾病有关[3]。miR-146a是炎症因子信号传导的重要物质，可能是导致牙周炎等慢性炎性疾病进展的重要因素[4]。但miR-23a、miR-146a与种植体周围炎的关系，目前尚鲜有报道，基于此，本研究通过检测种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a的水平，以期探讨两者与种植体周围炎的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年6月至2017年12月于本院行牙种植修复，并进行术后12个月复查的189例患者为研究对象，其中男100例，女89例，年龄25～75岁，平均(49.15±16.70)岁，种植体265枚。根据临床指标将患者分为：健康种植体组[探针深度(PD)≤3 mm，龈沟出血指数(SBI)≤2 ] 87例，其中男47例，女40例，年龄26～75岁，平均(49.91±16.70)岁，种植体109枚，炎症种植体组(PD>3 mm，SBI>2)102例，其中男53例，女49例，年龄26～73岁，平均(47.85±16.83)岁，种植体156枚。纳入标准：(1)口腔卫生良好，首次进行种植牙修复术；(2)患者自愿配合本次研究，资料获取完整；(3)患者均已签署知情同意书。排除标准：(1)有慢性咽炎、扁桃体炎等相关炎症疾病；(2)妊娠期、哺乳期妇女；(3)近期使用过抗生素、免疫制剂等药物；(4)伴有全身系系统性疾病患者。

同期选取在本院参与体检者78例作为对照组，男40例，女38例，年龄25～75岁，平均(50.12±16.35)岁，3组受试者性别、年龄等一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 龈沟液的采集 清水漱口，用无菌干棉球擦干牙面，隔湿进行取样，探针去除菌斑，气枪轻吹牙龈，将滤纸条(2 mm×20 mm)插入龈下约60 s，取出滤纸条，测量并记录浸湿长度，并将浸湿部分剪入装有100 μL生理盐水的EP管中，每管含2条滤纸(同一样本)，振荡1 h，在4℃离心机(1 000 r/min)上离心10 min，取上清液，置于-70℃冰箱中保存待测。

1.2.2 龈沟液的定量 用微量加样枪依次取人血清0.1～1.5 μL，分别滴在与1.2.1龈沟液采集同种规格的滤纸上，测量滤纸条浸湿长度，绘制滤纸条浸润长度与血清量关系的标准曲线(Y=0.010 24+0.148 31X，R2=0.997 7，P=0.000)，计算龈沟液量(gingival cervical fluid，GCF)。

1.2.3 临床指标测定 (1)PD：用牙签探针检查牙种植修复患者及正常人牙的近侧、远中颊侧，近中、远中舌侧，4个位点的PD，记录数据，并求取平均值。(2)检查并记录牙种植修复患者及正常人SBI，SBI评分标准：0：牙龈健康不出血，1：牙龈轻度炎症，2：牙龈轻度炎症，探诊后点状出血，3：牙龈中度炎症，探诊后血溢在龈沟内，4：牙龈重度炎症，探诊后血溢出龈沟，5：探诊后牙龈出血或自动出血。

1.2.4 龈沟液中miR-23a、miR-146a水平检测 采用qRT-PCR法检测龈沟液中miR-23a、miR-146a水平，取龈沟液上清待测样品，室温解冻，采用miRNA提取试剂盒提取样品总miRNA，采用反转录酶试剂盒将miRNA反转录成cDNA，采用qRT-PCR定量检测血清中miR-23a、miR-146a水平，实验过程参见试剂盒说明书，miRNA提取试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司，反转录酶试剂盒购自上海化科实验器材有限公司，miScript SYBR Green PCR Kit购自上海力敏实业有限公司。反应体系20 μL，反应条件：95℃：15 s；95℃：50 s；60℃：15 s，共40个循环。每份样品设3个重复。

miR-23a、miR-146a及内参U6的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法分析miR-23a、miR-146a的进行相对表达量。

表1 引物qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 3组受试者症状指标比较 炎症种植体组PD、GCF、SBI均显著高于对照组和健康种植体组(P<0.05)，健康种植体组PD、GCF、SBI与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

项目例数PD(mm)GCF(μL)SBI对照组782.53±0.450.70±0.240.65±0.23健康种植体组852.59±0.480.85±0.260.78±0.29炎症种植体组1024.26±1.02∗△1.91±0.60∗△3.25±1.04∗△F值169.509229.112438.533P值0.0000.0000.000

*与对照组比较P<0.05； △与健康种植体组比较P<0.05

2.2 3组受试者龈沟液中miR-23a、miR-146a水平比较 炎症种植体组患者龈沟液中miR-23a、miR-146a水平显著高于对照组和健康种植体组(P<0.05)，健康种植体组患者龈沟液中miR-23a、miR-146a水平显著高于对照组(P<0.05)，见表3。

项目例数miR-23a/U6miR-146a/U6对照组781.02±0.291.04±0.32健康种植体组851.88±0.56∗2.21±0.75∗炎症种植体组1022.95±0.92∗△3.87±1.17∗△F值136.832181.214P值0.0000.000

*与对照组比较P<0.05；△与健康种植体组比较P<0.05

2.3 不同性别种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平比较 不同性别患者种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

>60岁组患者种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平显著高于<40岁组和40～60岁组(P<0.05)，40～60岁组患者种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平与<40岁组相比，差异无统计学意义(P<0.05)，见表5。

项目例数miR-23a/U6miR-146a/U6男性532.92±0.863.81±1.07女性492.98±0.813.94±1.13t值0.3620.597P值0.7180.552

项目例数miR-23a/U6miR-146a/U6<40岁122.79±0.373.59±0.4540～60岁462.86±0.403.70±0.55>60岁443.10±0.49∗△4.10±0.78∗△F值4.3365.406P值0.0160.006

*与≤40岁组比较P<0.05；△与40～60岁组比较P<0.05

2.5 龈沟液中miR-23a、miR-146a水平与各临床指标的相关性 龈沟液中miR-23a水平均与患者PD、SBI呈正相关(P<0.05)，龈沟液中miR-146a水平均与患者PD、SBI呈正相关(P<0.05)，见表6。

表6 龈沟液中miR-23a、miR-146a水平与各临床指标的相关性分析

3 讨论

种植体周围炎是由多种因素引起的可逆炎症反应，据临床调查显示，种植体周围炎的发病率约为10%[5]，若治疗不及时，则可能使种植体周围支持组织丧失，形成种植体周围袋，最终导致种植体脱落，种植术失败[6]。其中引起种植体周围炎的风险因素主要有三类：菌斑、宿主因素(牙周炎、糖尿病、吸烟)、医源性因素(置入位置不佳、边缘不密合)[7]。因此有效规避引起种植体周围炎的危险因素，深入探究种植体龈沟液中相关生物学指标与种植体周围炎临床指标的关系，对提高种植体的成功率十分重要。

PD指牙周袋的深度，是重要的牙周临床指标之一，在炎症牙龈PD值通常高于健康牙龈，主要是因为测量时探针可穿透结合上皮，进入炎症结缔组织内，而健康牙龈探针尖端则终止于结合上皮。GCF是指通过沟内、结合上皮从牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体，一般情况下龈沟液流出量与牙周炎症程度成正比。SBI能够反映出牙龈炎症活动期的状况，是常见的牙周炎症临床指标。谢谦等[8]研究表明PD、GCF、SBI均高于对照组和健康种植体组，本研究与谢谦等的研究结果一致，结果显示，炎症种植体组PD、GCF、SBI显著高于对照组和健康种植体组，提示PD、GCF、SBI作为常见的牙周炎症临床指标能够反映种植体周围炎活动状况及炎症程度。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码的小分子RNA，长约22 nt，在各种生物体内表达广泛，能够参与细胞生长、分化、增殖与凋亡等生命过程，且在肿瘤疾病、内分泌疾病及炎症疾病中表达异常[9]。miR-23包括2种亚型，miR-23a与miR-23b，其中miR-23a具有广泛的基因调节功能[10]。李杰等[11]研究表明miR-23a在肺癌患者血清中表达上调。杨博等[12]研究表明miR-23a在炎症性牙龈和牙槽骨组织中表达上调可能调节具有调节炎性微环境中骨组织的代谢及调节成骨细胞、牙周膜细胞生物学特性的作用。本研究结果显示炎症种植体组患者龈沟液中miR-23a水平显著高于对照组和健康种植体组，健康种植体组患者龈沟液中miR-23a水平显著高于对照组，提示炎症种植体患者种植体龈沟液中miR-23a表达上调，miR-23a可能种植体周围炎的发生有关。

miR-146包括2个亚型，即miR-146a与miR-146b，其中miR-146a可参与炎症因子信号传导过程，具有调控免疫细胞分化及免疫功能的作用[13]。研究表明miR-146a在炎性组织中表达上调，与炎症反应的调节过程有关[14]。贺学农等[15]研究表明大鼠轻型脑创伤后，大鼠脑皮质中miR-146a表达显著上调，在促进脑创伤后炎症反应中发挥了重要作用。本研究结果显示，炎症种植体组患者龈沟液中miR-146a水平显著高于对照组和健康种植体组，健康种植体组患者龈沟液中miR-146a水平显著高于对照组，提示miR-146a可能与种植体炎症反应的发生有关。

郦兴[16]研究表明种植体周围炎龈沟液中炎症因子白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6及γ干扰素(IFN-γ)表达水平与种植体周围炎患者性别无关，但与患者年龄有关。本研究结果显示，不同性别患者种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平差异无统计学意义，但不同年龄段中，>60岁组患者种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平显著高于<40岁组及40～60岁组人群，提示患者种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a水平与性别无关，但可能与患者年龄有关，分析造成此类现象的主要原因有：老年人免疫功能减退，机体免疫系统对于炎性因子的清除较弱，因此可能存在miR-23a、miR-146a水平较高的现象。本研究通过pearson相关性分析结果显示龈沟液中miR-23a、miR-146a水平均与患者PD、SBI呈正相关，提示龈沟液中miR-23a、miR-146a水平与种植体周围炎患者牙周组织损伤的程度有关，可能反映种植体周围组织的健康状态。

综上所述，在种植体周围龈沟液中miR-23a、miR-146a表达上调，两者与种植体周围炎相关临床指标有关，可能成为反映早期种植体周围炎症进展及牙周组织损伤程度的生物标志物。然而本研究样本例数较少，下一步准备扩大样本容量，继续进行miR-23a、miR-146a与种植体周围炎相关生物学机制等的研究。