李雯 ，赖启南 ，张志成 *，李炜 ，陈勇平 ，肖影群

（1.南昌市第九医院，江西 南昌 330002；2.宁都县人民医院，江西 宁都 342800；3.宜黄县人民医院，江西 宜黄 344400）

全球估计有2.4亿人感染乙型肝炎病毒，这些感染者患肝硬化和肝细胞癌(HCC)的风险明显增加[1]。据统计，目前我国有慢性HBV感染者约9300万人，慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌[2]，我国肝硬化和HCC患者中，分别有60%和80%的比例是由HBV感染引起的[3]。因此，HBV感染已成为我国严重的公共卫生问题之一，长期威胁着我国人民的健康，同时造成严重的经济负担。

目前，临床上应用于抗HBV治疗的主要药物是核苷（酸）类似物（nucleoside analogues，NAs），我国主要使用的抗HBV治疗的NAs为拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韦（ETV）与替诺福韦酯（TDF）。NAs因抗病毒作用强、口服方便、不良反应小、价格相对易接受等优点在临床上应用广泛[4]，但是NAs的治疗缺点是停药难，需长期用药,随着NAs的广泛和长期应用,在治疗的过程中患者很容易发生HBV耐药突变[5]。因此,及时了解患者的耐药情况,可以更好的指导临床用药,帮助患者制定最佳的抗病毒治疗方案。

本文通过回顾性分析江西地区542例慢性乙肝患者的HBV基因分型和耐药相关位点突变的情况，为临床制定抗病毒治疗方案提供参考依据，帮助降低疾病进展风险。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2017年7月-2019年6月在我院进行HBV耐药检测和基因分析的542例慢性乙肝患者，其中男459例，女83例；年龄23～78岁，中位数年龄51岁。所有患者诊断均符合中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会2015年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》标准[4]，并且均排除有HIV，HAV，HCV，HDV共同感染以及免疫功能不全者。

1.2 仪器与试剂 病毒核酸提取纯化试剂盒，乙型肝炎病毒分型及耐药突变基因检测试剂盒，PCR扩增仪（ABI 7500），PCR分子恒温杂交仪（深圳亚能 YN-H16）。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA的提取 收集患者空腹静脉血5 ml，常温放置30 min，离心后取血清，-20℃保存备用。1.5ml离心管中先后加入HBV DNA提取液I和样品（待检血清或阴/阳质控品）各200uμl，振荡混匀，13000r/min离心 5min， 弃上清,加入 50μl HBV DNA提取液II，混合均匀至沉淀完全溶解，低速离心数秒后，100℃干浴或沸水浴 10min；2000r/min离心数秒，加入5μl三氯甲烷，振荡混匀，13000r/min离心5min；取上清3μl作为PCR反应模板。

1.3.2 PCR扩增 取出PCR反应管稍事离心，并在管盖上做好标记,加入3μl已提取的待测样本DNA，阴性质控及阳性质控同样处理。反应程序：50℃ 2min；95℃10min；94℃ 60s，68℃ 90s，30 个循环 ；94℃ 30s，54℃30s，72℃ 30s，30 个 循 环 ；72℃5min。

1.3.3 杂交 取15ml离心管，放入HBV基因分型及耐药突变检测膜条，然后加入5ml左右的A液，再加入25μlPCR扩增产物，100℃沸水浴中加热10min，取出离心管，放入杂交箱47℃杂交90min。

1.3.4 洗膜和显色 将杂交好的膜条转移至装有40ml B液（47℃预先预热好）的50ml离心管中轻摇15min。然后取出膜条放入孵育液（按A液/POD=2000/1的比例配置），室温轻摇孵育30min。弃孵育液，用A液室温摇洗2~3次，每次 5min。再用C液室温洗膜2min。再将膜条浸泡于显色液(10张膜体系：19mlC 液+1mlTMB+2μl30%H2O2)中避光显色10-15min，并用纯水终止显色反应。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对数据进行处理，计数资料组间比较采用χ2检验,以 P＜0.05为差异有统计学意义；计数资料以n(%)表示。

2 结果

2.1 结果判读 乙型肝炎病毒患者的血清经过HBV DNA的提取，PCR扩增以及与膜条的杂交、显色等过程后,可通过膜条各阵列的显色情况(蓝色斑点)直接判读HBV的耐药情况及其基因型,见图1。当膜条各阵列只有CC位点显色而其他位点不显色，则表明被检样本中的HBV病毒量低于本试剂的最低检测下限或者样本中不存在HBV。

2.2 HBV基因分型 经分型鉴定显示，542例CHB中共检出B、C、BC、BD及其他型等五种基因型,主要基因型为B型和C型,其中B基因型比例最大(83.0%，450/542),C 基因型次之(12.6%，68/542)。 此外,542例样本中共检测到耐药突变184例，耐药检出率为33.9%(184/542),并且耐药突变中以B、C 2种基因型为主体,其中B基因型151例,耐药检出率为33.6%（151/450），C基因型22例,耐药检出率为 32.4%（22/68），B、C基因型在耐药检出率方面无统计学差异（P>0.05）。具体情况见表1。

图1 HBV耐药测定及基因分型膜条示意图

表1 HBV基因分型结果

2.3 NAs药物的耐药情况 542例样本中共检测到耐药突变184例，耐药检出率为33.9%（184/542）；其中，出现突变的184例样本中LAM耐药例数为152（82.6%），LdT 耐药例数为 151（82.1%）,ADV 耐药例数为 50（27.2%），ETV耐药例数为 27（14.6%）,并且有 152（82.6%）例出现了多种药物耐药的情况。见表2。

2.4 HBV耐药突变位点分析 在184例发生耐药突变的样本中，共发现了20种不同的耐药突变模式，其中发生单个位点突变111例（60.3%），发生多个位点突变73例（39.7%）；单个位点以 rt204 I/V位点的突变检出率最高（33.7%，62/184），多个位点以rt204 I/V+rt180 M的突变检出率最高（22.3%，41/184）。见表3。对总的突变检出率进行分析显示,突变检出率最高的位点为 rt204 I/V（70.7%,130/184）,其次为 rt180 M（34.8%,64/184）,再次为 rt236 T（19.6%，36/184）。 见表 4。

表2 HBV耐药株分布情况[n(%)]

3 讨论

随着核苷酸类抗病毒药物的普及和用药时间延长，HBV耐药株带来的问题已经严重损害了CHB的健康,因此及时高效的检测出患者在治疗过程中是否出现了耐药显得尤为重要。检测乙肝耐药突变的方法有限制性片段长度多态性法、多温度单链构象多态性法、直接测序法和克隆测序法、线性探针分析法、基因芯片技术和核酸质谱检测技术等,其中基因芯片技术和Sanger测序法是目前运用最为广泛的两种技术[6]。

表3 HBV耐药位点分布情况[n(%)]

表4 HBV耐药位点分布情况[n(%)]

本研究采用PCR-反向点杂交基因芯片技术对来自江西地区542例CHB的基因型及其耐药突变情况进行检测。基因分型的结果显示江西地区HBV 分型主要以 B（83.0%）、C（12.6%）基因型为主，检测结果符合南方以B基因为主的结论，并且与本地区其他研究结果相吻合[7，8]；其中，B基因型的耐药检出率为33.6%（151/450）,C基因型的耐药检出率为 32.4%（22/68）；但是，B、C 基因型在耐药检出率方面差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，本研究还检测到BC混合型13例，BD混合型8例以及其他型3例,同时本研究发现混合型发生耐药的概率明显高于其他基因型,但是因为混合型基因型的样本量比较少,所以混合基因型是否与耐药突变存在关系还需进一步扩大样本量证实。

目前，临床上用于抗乙型肝炎病毒的NAs主要是拉米夫定、替比夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替诺福韦酯等几种药物，CHB患者在使用替诺福韦酯抗病毒治疗时病毒学应答率良好，8年随访研究暂未发现TDF相关耐药[9]。故而，本研究主要是针对前4中NAs药物进行突变位点的检测，检测的拉米夫定突变位点为rt204 I/V+rt180 M、rt204 I/V、rt181 V/T和rt207 I,替比夫定突变位点为rt20 4 I/V+rt180 M、rt204 I和 rt181 V/T，阿德福韦酯突变位点为rt181 V/T和rt236 I，恩替卡韦突变位点为rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V加rt184 I/S/A/F/L、rt250 I/L/V、rt202 G/I任意位点。

本文结果显示542例样本中有184例发生了不同程度的耐药位点突变,突变检出率为33.9%，该结果与滕菁等[10]（161/433，37.2%）和郭耿龙等[11]（67/182，36.8%）的研究结果相符；但是低于马军等[12](1193/2765，43.15%)和韩宇等[13]（46.87%，75/160）的研究结果；此外本研究结果又显著高于李少燕等[14]（30/255，11.8%）和许桂丹等[15]（63/869，7.25%）的结果。究其原因，可能与耐药基因屏障、突变对病毒适应力的影响、患者用药的规范性和用药史、地域不同等多种因素相关。

突变位点结果分析显示，共发现了20种不同的耐药突变模式，以 rt204 I/V（33.7%，62/184）单一位点突变和rt204 I/V+rt180 M(22.3%，41/184)联合位点突变为主，这两个突变均提示LAM和LdT联合耐药。有48（26.1%，48/184）例患者在rt236 T和rt181 V/T位点发生了突变,其中31例是rt236 T突变，该位点突变提示ADV耐药，13例患者是rt181 V/T突变，4例是rt236 T＋rt181 V/T联合突变，该17例患者提示发生了LAM、LdT和ADV联合多重耐药。ETV是高耐药基因屏障药物，除了预先存在的rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V耐药位点，还需要同时出现rt184 I/S/A/F/L、rt250 I/L/V和rt202 G/I任意位点突变[1],本研究中ETV相关的rt184、rt2 50、rt202三个位点发生突变的患者为37例，其中3例患者为rt184单一位点突变，5例为rt250单一位点突变、2例为rt202单一位点突变,其余27（14.6%，27/184）例患者均为rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V突变模式的基础上分别发生rt184、rt250、rt202任意位点的多重耐药突变，因此，LAM耐药的患者换用或加用 ETV治疗时需定期监测疗效，以防发生联合多重耐药。

本研究大样本回顾性分析江西地区慢性乙型肝炎患者HBV基因分型与耐药突变。提示江西地区NAs耐药检出率相对较高，且耐药突变模式复杂多样，有待深入研究，对患者在抗病毒治疗过程中定期进行NAs耐药检测对制定用药方案、提高抗HBV疗效以及预防耐药株的产生也具有重要的临床价值。