章白苓 ，徐轶 ，杭亚平 ，张楠 ，邹珊

（1.南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006；2.江西省人民医院，江西 南昌 330006）

曲霉菌属 （Aspergillus）是侵袭性曲霉菌病等的严重条件致病菌，部分患者病死率高达90%[1，2]，目前，临床曲霉菌感染均依据临床症状，培养分离等方法。近年来PCR技术被应用于曲霉菌的鉴定，但需要核酸扩增仪等昂贵仪器和专业操作人员,检测时间还是比较长,并且反应过程容易受污染的影响。本研究采用环介导恒温扩增 （Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP）技术,设计 2对引物来识别目标基因的6个不同区域,建立一种快速，简便，经济检测曲霉菌的方法,通过肉眼直接观察颜色变化来判断结果，并初步应用于临床。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本和标准菌株来源 临床标本（痰液）来自南昌大学第二附属医院临床微生物室,烟曲霉ATCC96918、黄曲霉 ATCC11492,来自上海复祥生物科技有限公司,白念珠菌ATCC 90029、热带念珠菌 ATCC66029、大肠埃希菌 ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎链球菌ATCC49619为本室保存。

1.1.2 仪器和试剂 Vitek-2全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃)、PCR扩增仪(美国ABI公司),Bst聚合酶（美国NEB公司），DNA marker(上海生工技术有限公司),试剂盒和荧光染料购自日本荣妍化学株式会社。DNA提取试剂盒购自广州达安基因公司。曲霉菌提取液：100mmol/L KCL,20mmol/lTris-HCL(PH8.3),5mmol/L Mgcl2，0.2g/L 明 胶 ，0.9%吐温20。烟曲霉、黄曲霉等临床常见曲霉菌感染菌，选取保守区域设计LAMP引物，外引物为F3和B3,内引物为FIP和BIP。序列分别为F3（5＇-GAGGATGCTTCGGGTGC-3＇）,B3 （5＇-CTCTACTTG TGCGCTATCGG-3＇）,FIP(5＇-ACCCCATCCCAGAC GGGATTCTGTCTAAGTGCCCTGGAAC-3＇),BIP(B1 C-B2)(5＇-TTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGTCTCCGGCCAGTATTTAGCT-3＇)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 纯菌DNA提取 曲霉菌DNA提取参照文献[3-5],将沙保平板纯菌落用无菌水洗涤，15000r/min离心5min,取200mg左右湿润菌落加100μl曲霉菌提取缓冲液，50μl溶细胞酶，37℃1h,再加入100μg蛋白质酶K，55℃ 1h,然后95℃灭活10min,最后15000r/min，4℃离心10min。上清液即为核酸扩增模板。

1.2.2 临床标本处理 痰液标本加入1~3倍痰液体积的胰蛋白酶（0.25%），置37℃水浴1h，2000r/min离心 3min,取上清夜 1ml，15000r/min 离心 5min，弃上清,在沉淀中加入100μl曲霉菌提取缓冲液，制成悬液，再按上述纯菌DNA提取方法操作。

1.2.3 LAMP检测 LAMP反应条件按照试剂盒说明书操作。LAMP反应体系：1.6μmol/l的引物FIP和 BIP，0.2μmol/l引物 F3 和 B3，1X LAMP 反应缓冲液 12.5μl，8U BstDNA 酶 1μl,荧光染料 1μl，2.5μl DNA 模板，纯水至 25μl。 64℃恒温 1.5h，最后80℃5min灭活，BstDNA酶终止反应。模板先进行95℃ 4min,然后冰上冷却处理，再加入2.5μl于上述反应体中，最后以肉眼观察颜色变化。

1.2.4 PCR检测 PCR反应体积为25ul，分别以两条 引 物 F3 （5＇-GAGGATGCTTCGGGTGC-3＇）,B3（5＇CTCTACTTGTGGGCTATCGG-3＇）。 其中引物各0.4umol/l，PCR 缓冲液 12.5μl,DNA 模板 2.5μl，超纯水至 25μl。 94℃预变性 5min，94℃ 30s， 退火55℃30s，72℃延伸 30s，共 30 个循环，最后 72℃延伸10min产物在含荧光染料的1.5%琼脂糖电泳，用凝胶成像系统观察结果。

1.2.5 敏感性试验 烟曲霉菌株按上述方法提取DNA 模板，纯化，制备系列分别含 100、50、5、0.5、0.05pg模板进行LAMP和PCR检测。

1.2.6 特异性实验 将烟曲霉菌、黄曲霉菌及各对照菌提取DNA分别进行LAMP扩增,观察特异性。

2 结果

2.1 特异性试验 LAMP法对烟曲霉、黄曲霉菌扩增后，呈现典型的梯型条带，肉眼观察，阳性扩增小管中呈现绿色混浊，而其他非曲霉菌，均未扩增出产物，肉眼观察小管呈阴性为橙红色,见图1、图2和表1。

2.2 敏感性试验 LAMP法检测烟曲霉菌最低浓度在0.05pg，PCR法检测则最低浓度为0.5pg,LAMP法比PCR法敏感性高10倍。在最低检测浓度时也能进行肉眼直接观察，见图3和表2。

图1 LAMP反应检出结果

图2 LAMP特异性检测结果

表1 LAMP扩增特异性试验检测结果

图3 烟曲霉菌LAMP法与PCR法敏感性检测结果比较

表2 LAMP法和PCR法敏感性的比较

2.3 临床标本检测 经涂片镜检、分离培养和PCR检测确诊的10例临床痰液标本,经处理和提取DNA，经LAMP扩增后，均为阳性。

3 讨论

LAMP技术是Notomi[6]等提出的一种新的核酸扩增技术，由于采取了2对引物来识别目标基因6个不同区段,而具有高度特异性,只需将反应混合液在恒温65℃条件下保持1h左右。反应过程快捷,检测结果直观可见,检测灵敏度比PCR方法高[7]。

侵袭性曲霉病是发生在免疫力低下人群中的一种机会性致病菌感染，IA）发生率逐年增加。此病进展快，早期诊断困难，病死率高，其死亡率在部分患者中可达70%～90%[8,9],其早基因诊断是抗菌治疗的关键，该病的临床症状不特异,影像学检查缺乏特异性，实验室诊断方法主要是分离培养，其培养阳性率低且耗时长。而分子生物学方法是曲霉菌感染诊断中最具有应用前景的一种方法[10]。

本研究采用LAMP技术应用于曲霉菌的诊断、简便快速。通过梯度稀释方法进行敏感性试验,发现LAMP和PCR检测最低浓度分别为0.05pg和0.5pg,相差10倍，与相关报道相似[5,11]，比PCR法有更高的敏感性。除曲霉菌阳性外，其余对照菌株均为阴性，特异性好。在10例确诊临床痰液标本检测中均为阳性。分子生物学方法，LAMP方法与传统PCR法相比，有着操作简单、经济、快速、敏感性和特异性好等特点[12-15],值得在临床推广应用。