李泓文，聂大林

（苏州赛谱仪器有限公司，江苏 苏州 215200）

0 引言

本次分析的对象是由北京卫星制造厂在科技部重大专项《高精度超高压液相泵的开发与应用》（项目编号：2016YFF0101000）项目中研制的高精度超高压液相泵（UHPLC-BSC-01型），使用该在研液相泵替代SCG蛋白纯化系统中的输液系统与原系统进行梯度性能对比测试并分析结果。

1 系统介绍

SCG蛋白纯化仪是由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、收集系统、数据处理系统等部分组成的分析、制备仪器。输液系统由泵、混合器、压力传感器组件等组成，是SCG蛋白纯化仪的重要组成部分。输液系统根据实际需求对仪器提供精准的等度和梯度液相输入。图1是SCG蛋白纯化仪及输液系统组成方框图。

赛谱仪器的SCG蛋白纯化系统是液相色谱仪器（LC）中的一种，基本原理和HPLC类似，但需要配置pH及电导率检测器，而且用途完全不同，所以系统与流动相接触的部分完全采用生物惰性材料。系统在低压运行时，有较低的脉动，从而避免损坏层析柱。该系统支持独立的样品泵，最多支持10个通道的样品选择，11个通道的流动相的选择，5根层析柱的自动选择，以及10个通道的大体积收集和组份收集器收集。SCG软件既能完全手动操作仪器进行蛋白纯化工作，又能支持方法编辑及运行，运行客户根据样品信息编辑的一个或多个方法，对仪器的整个工作流程进行全自动运行，系统能自动完成方法的运行并生成结果报告，实现蛋白的全自动纯化工作。

2 梯度洗脱

图1 SCG蛋白纯化仪及输液系统组成方框图Fig.1 The SCG protein purification instrument and the composition block diagram of the infusion system

进行高效液相色谱分析时，常采用两种洗脱方式，一种为等度洗脱（isocratic elution），另一种为梯度洗脱（gradient elution）[1]。

用等度洗脱进行色谱分离，由不同溶剂构成的流动相所组成，如流动相的极性，离子强度，pH等，在分离的全过程中皆保持不变。用梯度洗脱进行色谱分离时，在洗脱过程中含两种或两种以上不同极性溶剂的流动相组成，会连续或间歇地改变，期间可调节流动相的极性，改善样品中各组份间的分离度。梯度洗脱一般是指流动相组成，随分析时间的延长呈线性变化，即线性梯度洗脱[1]。

梯度系统可分为低压梯度系统和高压梯度系统。

低压梯度系统通过控制比例阀的开闭时间，而高压梯度系统通过控制泵的流量实现梯度洗脱[3]。

本文测试均为高压梯度系统。

1）测试依据：JJG 705-2014液相色谱仪检定规程。

2）环境条件：环境温度18℃～30℃，环境湿度≤75%。

3）流动相：A泵流动相为纯水，B泵流动相为0.4%丙酮。

3 梯度准确度和精密度测试

3.1 操作步骤

◆ 按图1流程连接高精度超高压液相泵、UV检测器、SCG工作站及管路后通电。

◆ 打开SCG工作站。

◆ A泵流动相为纯水，B泵流动相为0.4%丙酮溶液。

◆ 将出液口连接至UV检测器检测池。

◆ 分别运行A、B泵，待出液口有液体流出且管路内无气泡时停止运行。

图2 梯度方法曲线示意图Fig.2 Schematic diagram of gradient method curve

◆ 用A泵流动相冲洗管路并预热检测器，待基线平稳后进行梯度曲线测试。

◆ 将UV检测器波长设置为254nm，流速为1mL/min，运行方法得到梯度曲线，重复5次。方法曲线示意图如图2所示。

◆ 测量V1-V7的UV吸光度值并记录，根据式（1）、式（2）和式（3）可计算出梯度准确度Gs。

◆ 测量V1-V7的UV吸光度值并记录，根据式（2）和式（4）可计算出梯度精度RSD。

◆ 记录梯度方法的紫外吸收曲线图谱。

◆ 使用赛谱仪器进口泵SCG030进行对比测试。

每次梯度测试完成，先计算对应的实际值，公式如下:

表1 梯度精度测试结果的对比表Table 1 Comparison table of gradient accuracy test results

式（1）中：

Li——某一梯度每次测量的实际值（%）。

Vi——某一梯度每次测量的UV吸光度值（mAu）。

VA——A流动相100%时，UV吸光度值（mAu）。

VB——B流动相100%时，UV吸光度值（mAu）。

接着，计算对应的梯度误差，公式如下：

式（2）中：

Ls——某一梯度设定值（%）。

Ti——某一梯度每次测量的偏差值（%）。

然后，计算n次梯度测试的梯度准确度，计算公式如下：

式（3）中：

Gs——某一梯度5次测量偏差值的算术平均值（%）。

最后，计算n次梯度测试的梯度精度RSD，计算公式如下：

3.2 测试结果

按照上述步骤对高精度超高压液相泵和赛谱仪器进口泵进行对比测试，结果数据如表1所示。

4 梯度滞后体积测试

梯度滞后体积是指从溶剂配比完成点到色谱柱头的系统体积，也可称为延缓体积，相当于在梯度运行之前运行一段等度条件[2]。

实际观测到的梯度洗脱则是向后平移了一段时间，称为梯度系统的滞后时间，如图4(a)所示。在梯度洗脱开始与结束处的轮廓线理论上应为直线，但实际上由于梯度系统中的滞后体积导致系统内扩散，直线则变成了圆滑的线，这就使梯度洗脱的线性变差如图4(b)所示[1]。

图3 高压梯度系统中的滞后体积Fig.3 Hysteresis volume in a high pressure gradient system

图4 线性梯度轮廓Fig.4 Linear gradient profile

传统HPLC系统滞后体积一般在0.5mL～5mL范围内，通常采用4.6mm内径，150mm或更长的色谱柱，分析时间10min～20min之间或更长时间，滞后体积影响并不显著。但是随柱长变短，内径变细，较大的滞后体积可能会引起保留时间明显增加，色谱分离情况发生变化。因此，应选滞后体积小的液相色谱仪，以适应梯度试验。高压梯度系统中滞后体积如图3所示[2]。

4.1 操作步骤

◆ 按图1的流程连接进高精度超高压液相泵、UV检测器、SCG工作站及管路后通电。

◆ 打开SCG工作站。

◆ A泵流动相为纯水，B泵流动相为0.4%丙酮溶液。

◆ 将出液口连接至UV检测器检测池。

◆ 分别运行A、B泵，待出液口有液体流出且管路内无气泡时，停止运行。

◆ 用A泵流动相冲洗管路并预热检测器，待基线平稳后进行梯度曲线测试。

◆ 将UV检测器波长设置为254nm，流速为1mL/min，运行方法得到梯度曲线，重复5次。方法曲线示意图如图2所示。

图5 梯度滞后时间参考值测量方法图Fig.5 Gradient lag time reference value measurement method diagram

◆ 确保每个梯度比例运行至紫外吸收曲线平稳后，通过SCG软件测量V3-V4的UV吸光度开始变化至V4基线平稳所需的时间，如图5所示。V4-V5，V5-V6，V6-V7用相同方法测得，并计算其平均值作为梯度滞后时间对比的参考值，并记录测试结果。

◆ 使用赛谱仪器进口泵SCG030进行对比测试。

4.2 测试结果

见表2。

表2 梯度精度测试结果的对比表Table2 Comparison table of gradient accuracy test results

5 结论

通过将国产高精度超高压液相泵与赛谱仪器紫外检测器组成的液相色谱系统进行梯度性能测试，并且与赛谱仪器原有的由进口液相泵组成的蛋白纯化系统进行对比，从试验结果可以得出：该国产高精度超高压液相泵在梯度准确度和梯度精密度两项指标上的表现均略优于赛谱仪器有限公司使用的进口液相泵SCG030；而从梯度的滞后时间（梯度滞后体积）参考值的测试结果表可得出：该国产高精度超高压液相泵的梯度滞后表现明显优于赛谱仪器使用的进口液相泵SCG030，其具有更好的梯度洗脱线性，且更适合用于细内径色谱柱的应用。